基于MTB基因分型的精准医疗对结核病传染情况的影响*

向长港 童胜兰 徐曙玲 高媚媚 孙 曼 刘本德

湖北省武汉市江夏区第一人民医院 430200

结核病为结核分枝杆菌(MTB)感染导致的一类疾病,有着较高的致死率,通常多出现在肺部,也能出现在其他的器官或者组织,例如骨结核以及脑结核等[1]。我国属于结核病感染较为严重的国家,掌握疾病传播规律是开展结核病防控工作的关键[2]。因此,对当地开展结核病传染流行病学分析,掌握近期传播率意义重大。另一方面伴随临床上抗结核药物广泛以及不合理应用,使得MTB产生耐药性,其危害会严重威胁人们的健康以及生命安全[3]。虽人们已对耐药结核进行了较多研究,包含耐药结核病诊断、结核分枝杆菌耐药机制和耐药结核病防治等方面,但目前临床依旧无治愈疾病的有效方法。精准医疗是一类将个人基因、环境和生活习惯差异等考虑在内的疾病预防和处置的新方法,是当下疾病医学治疗的前沿探索。近些年来,伴随高通量测序有关技术迅速发展及测序成本骤减,全基因组测序逐渐被使用到各类疾病致病机制和药物治疗等方面[4]。基于此,采取基因组测序测定MTB开展分子流行病学研究,和患者具体信息结合监测当地的结核病近期传播情况,对分析结核病疫情、拟定有效干预措施以控制疾病流行有着重要意义。本文现对2020年1—12月本地区98例结核病患者的98株MTB和2021年1—12月本地区100例结核病患者的100株MTB进行研究,分析精准医疗下基于MTB基因分型的结核病传染情况,具体内容如下。

*基金项目:湖北省卫生健康委员会科研项目(WJ2021M042)。通信作者:刘本德

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2020年1—12月本地区98例结核病患者的98株MTB和2021年1—12月本地区100例结核病患者的100株MTB进行研究,鉴定结果均是MTB,并选择标准菌株H37Rv当作对照,由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂:结核分枝杆菌药敏和菌种鉴定培养基为珠海贝索生物技术有限公司提供;2倍PCR预混液、D2000 DNA marker以及琼脂糖由北京永兴生科科技有限公司提供,引物是北京擎科新业生物技术有限公司合成。

1.2.2 菌株培养:将每100ml基础培养基内加入1ml配制稀释过的抗结核药物,充分混匀,无菌分装成为7ml/管,在85℃环境内进行50min凝固处理,对制作而成培养基37℃开展无菌试验之后放到4℃环境下避光保存,有效期是1个月。

1.2.3 药敏试验:采取比例法,严格依据有关标准程序开展操作,所用的药物主要包含异烟肼、利福平、链霉素、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等,终浓度依次是0.2μg/L、40.0μg/L、2.0μg/L、30.0μg/L、4.0μg/L。当耐药百分比不低于1%时,说明受试菌对于该药存在耐药现象;相反,则代表受试菌对于该药敏感。

1.2.4 MTB有关DNA提取:刮取培养基斜面中生长较好的结核分枝杆菌1标准环,在400μl的TE缓冲液(酸碱度值为8.3)内悬菌,在85℃环境下开展30min灭活处理,在100℃环境下进行10min煮沸,以12 000r/min速度进行10min离心处理,后选择上清液为DNA模板,放到-20℃的环境内保存待测。

1.2.5 全基因组测序方法:由北京诺禾致源生物科技股份有限公司进行检测,选择高通量的二代Illumina测序平台,开展DNA片段有关文库构建,予以双端测序,PE150,深度≥200×,各样品的总测序深度有关数据量不低于1G Clean Data。测序的原始数据分别是Scythe、Sickle两个软件开展滤过,低质量碱基(即质量不超过38)、N碱基比例超过10bp、和Adapter之间overlap超出15bp与可能源自宿主reads,获得的Clean Data被应用到后续分析中。将H37Rv菌株有关全基因组序列当作参考模板,采取BioEdit软件开展对比获取单株菌株单核苷酸多态性(SNP)。后将SNP数据和已经报道的MTB耐药基因突变数据库开展比较,得到每株菌株对于一线类抗结核药物耐药突变基因类型。菌株分型是每株菌株SNP和H37Rv开展比较,得到每株菌株基因型。

1.2.6 治疗方法:2020年患者采取常规治疗措施,即2HRZE/4HR化疗方案,异烟肼片(上海信谊药厂有限公司,100mg×100片,国药准字H31020495)0.3g/d;利福平胶囊(上海衡山药业有限公司,0.15g×100片,国药准字H31021101)0.45g/d;吡嗪酰胺片(上海信宜药厂有限公司,0.25g×100片,国药准字H31020800)1.5g/d;盐酸乙胺丁醇片(广东台城制药股份有限公司,0.25g×100片,国药准字H44023635)0.75g/d。以上4类药物口服2个月,后继续口服4个月的异烟肼片和利福平胶囊。2021年患者采取精准治疗方案,即结合患者的MTB药敏试验、基因测序分型情况,并和其年龄、性别、居住地及日常作息等方面予以个体化治疗,并与临床医师直接沟通,对患者信息进行持续追踪,合理调整治疗方案。

1.3 观察指标 比较2年内MTB耐药率、成簇率以及近期传播率变化,并统计MTB耐药基因分布情况。耐药率=耐药数/总数×100%;结合基因型是否相同评定菌株为成簇或者独立,其中完全相同VNTR基因型菌株不低于2个为成簇[5];近期传播率按照(nc-c)/n的公式计算,其中nc为成簇菌株,c是菌株成簇数,n是所有菌株样本[6]。此外,比较2年内患者的疗效差异,包含治愈率和再传染率两项指标,将治疗后患者连续3次痰涂片转阴评定成治愈,治愈率=治愈数/总数×100%;再传染率=未治愈人数/总数×100%[7]。

2 结果

2.1 2年内MTB耐药率变化情况相比 和2020年相比,2021年MTB耐药率和耐多药率有一定升高(P<0.05),见表1。

表1 2年内MTB耐药率变化情况比较

2.2 2年内MTB成簇率以及近期传播率变化比较 和2020年相比,2021年MTB成簇率和近期传播率有一定升高(P<0.05),见表2。

表2 2年内MTB成簇率以及近期传播率变化比较

2.3 198株MTB耐药基因分布情况 对几类药物耐药基因的分布情况开展统计后发现,占比最高的基因是katG基因,

为17.68%;其次是rpoB基因,为13.13%。几类药物中吡嗪酰胺耐药基因占比总体处在较低水平,见表3。

表3 198株MTB耐药基因分布情况

2.4 2年内疗效比较 2021年患者的治愈率高于2020年患者,再传染率低于2020年患者(P<0.05),见表4。

表4 2年内疗效比较[n(%)]

3 讨论

肺结核属于一类常见呼吸道传染病,是MTB感染所致,当前已经成为备受关注的一个重要公共卫生问题。据有关资料显示[8],全球范围内每日有约5 000人因结核病而死亡,在以往200年中共有10亿人因结核病死亡。MTB基因分型属于一类分子流行病学有关研究方法,其将基因分型技术和流行病学资料结合,对来源不同的MTB开展基因特性对比,以揭示结核病流行和传播规律,是结核病监测中的有效措施。同时这项技术从分子水平方面对传染源追踪与溯源、划分外源性感染和内源性复燃等具备重要价值,当前已被广泛使用到流行病学中[9]。本次研究发现:对198株MTB耐药基因突变情况开展检测,得出占比最高的基因是katG基因,为17.68%;其次是rpoB基因,为13.13%;几类药物中吡嗪酰胺耐药基因占比总体处在较低水平。该结果一定程度反映出本地区的吡嗪酰胺耐药水平,提示一线抗结核药吡嗪酰胺于本地区依旧具备较高应用价值。

和2020年相比,2021年MTB耐药率、耐多药率以及MTB成簇率、近期传播率有一定升高(P<0.05),说明本地区的结核病耐药现象正不断加重,疾病的防控形势依然较为严峻。考虑原因可能是近年来部分结核病患者于综合医院内接受治疗,无法确保完成全程治疗,而不规则的抗结核治疗属于生成耐药菌的主要因素;患者治疗期间的依从性不佳,症状略微改善就尽早停止用药,也会引起结核菌耐药现象,导致病情进一步传播[10-12]。因此,需要提高对结核病患者治疗工作的重视程度。精准医疗理念的提出使得结核病防治进入了精准医学时代,对提升结核病治疗水平、阻断疾病在人群内的传播有着重要意义[13]。本文研究显示:2021年患者的治愈率高于2020年患者,再传染率低于2020年患者(P<0.05),说明对结核病患者开展精准治疗能提升其治愈率,降低疾病再传染率。分析原因是精准治疗和患者的实际情况更符合,能使各项治疗措施的效果最优化,进而提升对疾病的防治效果。

总而言之,MTB耐药率、成簇率以及近期传播率近年来呈现升高趋势,且吡嗪酰胺的耐药基因占比相对较低,临床需提高对结核病传播以及治疗工作的重视程度,结合患者具体情况开展精准医疗,以提升患者疗效,控制疾病传播。但本文依旧有不足之处,如纳入的样本数量不多,样本全部源自同一家医院,且未对患者的远期随访结果进行统计,得到的结果有局限性,这些均需在日后加以完善,获得更为全面的结果,更好地指导临床实践。