一株肠道分离的噬菌体对临床金黄色葡萄球菌裂解作用的评价*

李玉忆 高玉录

南京中医药大学附属昆山市中医医院,江苏省昆山市 215300

金黄色葡萄球菌是临床常见的重要病原菌之一,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)。MRSA感染具有难治疗和高死亡率的特点,已经给全球医疗机构带来了沉重的负担[1]。由于它对最常用抗生素的耐药性,MRSA感染患者的治疗选择非常有限[2]。近几十年来还出现了MRSA对万古霉素以及相对较新的药物如利奈唑胺和达托霉素的抗性[3],使得治疗非常棘手。目前,噬菌体疗法是一种治疗MRSA极具前景的抗生素替代方案,正以其高效力和高特异性,重新得到人们的关注。而噬菌体治疗的成功取决于所分离的噬菌体特性及其与宿主的适应性。本研究旨在评估分离源自病人肠道的噬菌体在治疗金黄色葡萄球菌感染中的价值。

1 材料和方法

1.1 细菌菌株及培养条件 本研究采用的1～60号菌为从本院临床标本中分离并保存的金黄色葡萄球菌菌株,标准菌株ATCC43300为微生物实验室质控保存的菌株。所有细菌都在血平板上37℃生长。

1.2 噬菌体分离 收集本院金黄色葡萄球菌感染的病人的新鲜粪便5g,加入100ml普通液体培养基内,于37℃温箱孵育过夜。次日70℃加热30min后离心15min,上清液通过0.22μm的膜过滤器(Millipore)灭菌。将10ml样品与指数期宿主细胞(金黄色葡萄球菌ATCC43300)加入10ml胰蛋白酶大豆肉汤(TSB,Sigma)中,在37℃、140r/min条件下孵育过夜。次日将混合液4℃离心15min,上清液通过0.22μm膜过滤器灭菌。将1ml过滤后的有效样品上清液与宿主细胞和5ml软琼脂(Oxoid)充分混合,然后将其覆盖在胰蛋白酶大豆琼脂平板上(TSA,Sigma),在37℃孵育过夜。当观察到清晰的嗜菌斑后,取单个斑块加入3ml含宿主菌株的TSB中于37℃、140r/min下孵育过夜。重复双琼脂层法直到只存在单一的嗜菌斑。分离后的噬菌体于SM缓冲液(Phygene)中4℃保存。

1.3 细菌鉴定和抗菌药物敏感性分析 采用全自动细菌鉴定和药敏仪VITEK2 Compact(生物梅里埃)依照设备标准说明书进行。药敏结果根据美国临床实验室标准化协会(Cinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南标准判读。

1.4 噬菌体宿主范围分析 将0.1ml的过夜细菌培养物(OD600=0.1)加入5ml的软琼脂中,然后覆盖在营养琼脂平板(Oxoid)上,待凝固后将纯化的噬菌体点到每个细菌平板上,37℃孵育过夜后观察噬菌斑形成情况。

1.5 大蜡螟幼虫模型 大蜡螟幼虫(新盛生物技术有限公司)储存在4℃的黑暗环境中,使用时选择重量在200～300mg之间的健康幼虫。取隔夜细菌培养物OD600为0.3,用10μl Hamilton注射器(Fisher Scientific)将5μl稀释的细菌悬浮液注入每只幼虫右腿。感染2h后,向治疗组的幼虫对侧前腿注射5μl的噬菌体。对照组未予噬菌体治疗。注射后的幼虫在37℃培养皿中培养。每组随机分配10只幼虫。另设一个空白组没有接受任何注射,一个磷酸缓冲盐溶液(PBS)组只注射PBS以评估与创伤有关的死亡。每24h记录一次存活率并持续7d,当幼虫变黑或对触摸无反应时标记为死亡。进行三个独立的重复,结果以生存曲线的形式呈现。

1.6 统计学方法 用GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software Inc., CA)分析数据。用对数秩检验分析大蜡螟虫的存活率,以P≤0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 金黄色葡萄球菌药敏试验结果 从肠道样本中成功分离出可裂解标准菌株ATCC43300的噬菌体SY01对于临床金葡菌具有不同的裂解作用。无嗜菌斑形成(-)的菌株有33.3%(20/60),可见噬菌斑形成的菌株占66.7%(40/60)。其中,根据噬菌斑情况(见图1)分类,噬菌斑+占21.7%(13/60),噬菌斑++占35%(21/60),噬菌斑+++占10%(6/60),见表1。

(+) (++) (+++)

表1 临床金黄色葡萄球菌药敏试验结果

2.2 金黄色葡萄球菌对多种抗生素耐药性及噬菌体SY01对MRSA、MSSA的作用 60株临床金黄色葡萄球菌抗生素耐药性分析显示,大多数菌株对所检测的多种抗生素耐药。其中对苯唑西林耐药率78.3%,即MRSA占78.3%(47/60),对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)占21.7%(13/60),对红霉素耐药率为80%(48/60),未检测到对万古霉素和利奈唑胺耐药(0/60),见表1。噬菌体敏感性分析显示46.2%(6/13)的MSSA和72.3%(34/47)的MRSA对SY01噬菌体敏感,两者无统计学差异,表明噬菌体SY01具有较宽的裂解宿主范围,对MRSA和MSSA均有裂解作用。

2.3 噬菌体SY01治疗对金黄色葡萄球菌感染大蜡螟幼虫生存率的影响 感染金黄色葡萄球菌ATCC43300后,对照组的幼虫在3d内全部死亡。使用噬菌体SY01的治疗组在第3天存活率为40%,第7天存活率为10%(P<0.05)。空白组和PBS组的7d存活率分别为100%和90%,两者无统计学差异(P>0.05),表明注射引起的损伤与幼虫死亡率无关。

3 讨论

本研究从病人肠道分离一株可裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体SY01,并通过体外和体内实验评估了其治疗金葡菌感染的潜在应用价值。结果显示,此次分离的噬菌体SY01可以裂解近2/3临床金葡菌菌株,表现出较宽的裂解宿主范围,多重耐药的临床菌株对该噬菌体表现出较好的敏感性,MRSA的敏感性高达72.3%。体内实验显示,金葡菌感染后的幼虫经该噬菌体治疗7d存活率高于对照组,提示该噬菌体具有抗金黄色葡萄球菌感染的应用前景。

本实验中有1/3的临床金黄色葡萄球菌菌株表现出对该噬菌体耐受,表明细菌抵抗噬菌体机制的存在。总体来说噬菌体感染的过程包括五个阶段,分别为附着、摄取、生物合成、组装和裂解[4]。目前关于葡萄球菌的噬菌体抗性研究关注于附着、生物合成和组装这三个阶段:(1)噬菌体感染的首个步骤是噬菌体附着在葡萄球菌细胞的外部。如果细菌表面的受体分子不存在或被阻断,噬菌体无法识别受体从而影响它的吸附。受体的相关突变可以通过抑制噬菌体吸附而导致噬菌体抗性的产生。分子研究显示,通过删除参与壁磷壁酸(WTA)生物合成的第一个基因,十一烯丙基磷酸N-乙酰葡糖胺1-磷酸转移酶(tagO),金黄色葡萄球菌表面的主要受体发生改变,从而表现出对测试的噬菌体(Φ812和ΦK)的抵抗[5]。(2)其次,在噬菌体的生物合成阶段中可能存在抵抗机制。限制性修饰(R-M)系统是金黄色葡萄球菌感染的一个重要障碍,它能通过降解注入的噬菌体DNA来干扰其生物合成[6]。所有四种类型的R-M系统都存在于金黄色葡萄球菌中:Ⅰ型R-M系统是金葡菌中最丰富的R-M系统类型,其次是Ⅳ型和Ⅱ型系统,Ⅲ型系统很罕见[7]。R-M系统是一个模块化操作子,包含编码三种功能的宿主特异性决定因素(hsd)的组合[8]。毒素—抗毒素(T-A)系统也通过干扰噬菌体的生物合成在细菌的抗噬菌体过程中起作用。例如Ⅲ型ToxN/Iyizhi对抗噬菌体A2M1[9],Ⅳ型系统AbiE/Id对抗多种噬菌体[10]。本研究组发现金黄色葡萄球菌T-A系统相关位点SAUSA300_2026的突变导致噬菌体敏感性改变,证明了Ⅱ型T-A系统在金黄色葡萄球菌防御噬菌体中的重要作用[11]。此外,另一种细菌的防御方式是簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPRs),它以序列特异性方式裂解外部DNA从而获得对噬菌体感染的免疫力[12]。(3)再者,在噬菌体进入细菌通过宿主环境合成所需元件后的组装过程中也可能受到外来因素的干扰,导致噬菌体的组装发生错误而影响其进一步增殖。研究显示SaPI在抢夺噬菌体组装元件过程中发挥了重要作用[13]。 最近,Doron等人在研究中发现了26个新的细菌抗噬菌体防御系统[4],在10个验证的抗噬菌体防御系统中有5个在葡萄球菌基因组中有关联,这可能意味着更多的防御机制和金葡菌抵抗噬菌体作用有关。本研究中发现的临床菌株9号、14号、26号较标准菌株对该噬菌体更加敏感,对其深入研究可能揭示更多噬菌体宿主适应性的信息。

然而本研究依然存在局限性,例如未进行噬菌体SY01的测序和分类,无法全面了解其生物学特性;未对相关噬菌体敏感和耐受的临床菌株进行基因分型以揭示各个不同特征临床菌株对噬菌体敏感性的联系,这也是本研究将来继续进行的课题。

本研究从病人肠道分离得到一株可以裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体,并针对此噬菌体对临床菌株的裂解作用进行评价,揭示了此噬菌体对临床金黄色葡萄球菌的裂解能力不受细菌耐药性的局限,体外实验和体内实验证实,该噬菌体在临床MSSA和MRSA中均有较好的活性,具有治疗临床金黄色葡萄球菌感染的潜在能力。