血清微小RNA-4731-5p和间皮素水平与需治疗原发免疫性血小板减少症发生相关性研究

陈 哲,袁小飞,康虹阳,张 斌,佟长青,高炳华

(河北北方学院附属第一医院血液科,河北 张家口 075061)

原发免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia,ITP)是一种常见的自身免疫性疾病,特点为自身免疫紊乱介导血小板(Platelet,PLT)破坏加速和巨核细胞生成血小板PLT不足,主要临床症状为黏膜出血、皮肤淤点淤斑,严重者可能发生内脏、颅内出血,对患者生命健康构成严重威胁[1-2]。目前ITP常用治疗方法为糖皮质激素治疗,然而此方法治疗效果个体化差异较大,复发率较高,且易发生不良反应[3]。因此,发掘与ITP有关的生物学标志物,对ITP的预防及早期诊断具有重要意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类高度保守的非编码小RNA,长度约20～25个核苷酸,研究[4-5]发现其参与调控免疫细胞的生长、分化及凋亡,进而影响机体免疫平衡。既往研究[6]显示,微小RNA-4731-5p(miR-4731-5p)在急性髓系白血病患者血清中呈低表达,且可作为治疗靶点影响急性髓系白血病的预后和进展。目前已知miRNA多是通过调控其靶基因在疾病中发挥调控功能的。于是,本研究通过生物信息学预测发现间皮素(Mesothelin,MSLN)是其潜在的靶标基因之一。MSLN是一种细胞膜糖蛋白,正常情况下在胸膜、心包和腹膜内壁的间皮细胞中呈低表达,但在急性髓系白血病患者中呈高表达[7]。急性髓系白血病存在造血功能异常使PLT减少,血清miR-4731-5p、MSLN均参与急性髓系白血病的发生与进展,因此推测血清miR-4731-5p、MSLN可能与ITP存在一定联系。基于此,本研究探讨血清miR-4731-5p、MSLN表达与ITP的相关性,以期为ITP的诊治提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2020年5月至2023年6月本院诊治的ITP患者118例为研究对象,其中男性53例,女性65例;年龄18～65岁,平均(44.25±6.55)岁。根据PLT计数将ITP患者分为需治疗组(62例,PLT<30×109/L,伴或不伴出血)和需观察组(56例,PLT≥30×109/L,近期无出血)。病例纳入标准:符合成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国指南(2020年版)[8]中ITP相关诊断标准;病历资料完整;入组前未接受过ITP相关治疗。排除标准:合并恶性肿瘤;继发性PLT减少症;存在内分泌障碍;重要脏器功能不全;存在精神疾病;妊娠。另选取同期体检健康者60例为对照组。三组一般资料比较差异无统计学意义(均P>0.05),见表1。本研究经医院伦理委员会批准,受试对象均签署知情同意书。

表1 三组一般资料比较

1.2 研究方法

1.2.1 血常规测定:入院后抽取受试者空腹肘静脉血8 ml,分成两份。一份血液样本采用全自动血液分析仪(美国贝克曼库尔特公司,型号LH750)对白细胞计数、血红蛋白、PLT及平均血小板体积(MPV)进行测定。另一份血液样本高速(4170 r/min)离心10 min分离上清,保存于-70 ℃。

1.2.2 血清miR-4731-5p测定:采用实时荧光定量PCR法对血清miR-4731-5p水平进行测定。血清解冻后,应用TRIzol试剂(批号:IH51641,威海威高生物公司)提取总RNA,按照反转录试剂盒(批号:IH19152,威海威高生物公司)说明书操作反转录得到cDNA,随后使用PCR仪进行扩增(美国伯乐公司,型号FQD-16B),以U6为内参基因。反应条件:95 ℃预变性180 s;95 ℃ 变性15 s,61 ℃退火28 s,73 ℃延伸19 s,共38个循环。miR-4731-5p正向引物序列为5’-GCTGGGGGCCACATACGGTTAGCA-3’,反向引物序列为5’-CTCTACAGCTATATTGCCAGCCAC-3’。U6正向引物序列为5’-CTCGCTTCGGCAGCACAC-3’,反向引物序列为5’-AACGCTTCACGAATTTGGT-3’。根据2-ΔΔCt法计算miR-4731-5p相对表达量,每个样本重复3次,取平均值。

1.2.3 血清MSLN测定:采用酶联免疫吸附法,根据试剂盒(批号:BSD-1931,武汉博士德生物公司)说明书对血清MSLN水平进行测定。

2 结 果

2.1 三组血常规比较 见表2。对照组、需观察组、需治疗组性别、年龄、BMI、过敏史、白细胞计数、血红蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05);对照组、需观察组、需治疗组PLT水平依次降低,MPV水平依次升高(均P<0.05)。

表2 三组血常规比较

2.2 三组血清miR-4731-5p和MSLN水平比较 见表3。对照组、需观察组、需治疗组血清miR-4731-5p水平依次降低,MSLN水平依次升高(均P<0.05)。

表3 三组血清miR-4731-5p和MSLN水平比较

2.3 ITP患者血清miR-4731-5p、MSLN、PLT、MPV间的相关性 Pearson相关性分析显示,ITP患者血清miR-4731-5p与MSLN呈负相关(r=-0.683,P<0.05);miR-4731-5p与PLT呈正相关,与MPV呈负相关(r=0.401、-0.564,均P<0.05);MSLN与PLT呈负相关,与MPV呈正相关(r=-0.429、0.460,均P<0.05)。

2.4 需治疗ITP发生的影响因素分析 见表4。以需治疗ITP是否发生为因变量(否=0,是=1),以PLT(≥54.81×109/L=0,<54.81×109/L=1)、MPV(<11.26 fl=0,≥11.26 fl=1)、miR-4731-5p(≥0.72=0,<0.72=1)、MSLN(<5.22 μg/L=0,≥5.22 μg/L=1)为自变量进行多因素Logistic回归分析。结果发现,低水平PLT、高水平MPV、低水平miR-4731-5p、高水平MSLN是需治疗ITP发生的独立危险因素(均P<0.05)。

表4 需治疗ITP发生的影响因素Logistic分析

2.5 血清miR-4731-5p、MSLN对需治疗ITP发生的预测价值 见表5(图1)。ROC曲线分析结果显示,血清miR-4731-5p、MSLN、两者联合预测需治疗ITP发生的AUC分别为0.861、0.850、0.927,两者联合预测的AUC显著大于miR-4731-5p单独预测的AUC(Z=1.999,P=0.046)和MSLN单独预测的AUC(Z=2.221,P=0.026)。

图1 血清miR-4731-5p、MSLN预测

表5 血清miR-4731-5p、MSLN对需治疗ITP发生的预测价值

3 讨 论

ITP是一种出血性疾病,为血液科常见疾病之一,具有较高的发病率[9-10]。ITP主要由于PLT自身抗原免疫耐受性丢失,从而体液及细胞免疫共同作用导致PLT数量减少[11-12]。PLT减少极易导致患者皮肤黏膜出血、关节出血、牙龈出血、消化道出血等,严重者可能发生脑出血甚至死亡,对患者生活质量和生命安全产生极大影响[13-14]。目前,针对ITP首选治疗药物为糖皮质激素,虽然疗效显著,可快速缓解症状,但使用时间过长患者易形成激素依赖,且可能会出现高血糖、睡眠障碍、情绪不稳定等多种不良反应[15]。因此,探寻与ITP有关的标志物,对于寻找诊治ITP的治疗靶点和改善ITP患者预后具有重要意义。

PLT计数是PLT生成及衰老的主要指标,PLT水平下降是造成出血的重要原因[16]。MPV反映PLT体积大小,与PLT密切相关[17]。本研究发现,对照组、需观察组、需治疗组PLT水平依次降低,MPV水平依次升高,表明ITP患者存在着凝血功能异常。据报道,PLT数量及MPV可反映PLT功能状况和患者病情程度,结合以往研究得出,在ITP疾病进展过程中,PLT破坏过多,骨髓巨核细胞增生活跃,PLT代谢旺盛,进而导致MPV迅速增大[18]。MPV水平升高,进而激活机体炎症和凝血系统,使出血风险增加[19]。

既往研究[20-21]发现,多种miRNA在自身免疫性疾病中异常表达,且不同出血分级、类型患者之间也存在显著性差异,提示miRNA可能与ITP的发生、发展有关。miR-4731-5p为miRNA家族成员之一,研究[22]发现miR-4731-5p异常表达与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关。Han等[6]研究显示,miR-4731-5p在急性髓系白血病患者中呈低表达,且参与急性髓系白血病的发生与发展。本研究结果显示,需观察组和需治疗组ITP患者血清miR-4731-5p水平显著低于对照组,且需治疗组ITP患者血清miR-4731-5p水平低于需观察组ITP患者,提示miR-4731-5p可能参与ITP的发生,并且会影响ITP的疾病进展。相关性分析显示,ITP患者血清miR-4731-5p与PLT呈正相关,与MPV呈负相关,表明miR-4731-5p水平与PLT和MPV可能存在相互作用,影响ITP的发病。

MSLN是一种细胞表面分化抗原,在胸膜、心包间皮细胞和腹膜内壁间皮细胞中呈低表达,在多种恶性肿瘤如肺癌、卵巢癌中呈高表达[23-25]。Wang等[7]研究发现,MSLN在急性髓系白血病患者中呈高表达,减少MSLN的水平可降低急性髓系白血病的严重程度。本研究结果发现,对照组、需观察组、需治疗组血清MSLN水平依次升高,提示MSLN可能在ITP的发生、发展中发挥重要作用。相关性分析显示,ITP患者血清MSLN与PLT呈负相关,与MPV呈正相关,且血清miR-4731-5p与MSLN呈负相关,表明miR-4731-5p和MSLN可能存在调控关系,参与ITP的发病过程,然而其具体作用机制尚需深入探究。本研究还发现,低水平PLT、高水平MPV、低水平miR-4731-5p、高水平MSLN是需治疗ITP发生的独立危险因素。以上结果提示,临床上要重点关注ITP患者PLT、MPV、miR-4731-5p、MSLN水平变化,及时给予干预以预防需治疗ITP的发生。ROC曲线分析结果发现,血清miR-4731-5p和MSLN联合预测需治疗ITP发生的AUC显著大于miR-4731-5p单独预测的AUC以及MSLN单独预测的AUC,提示miR-4731-5p、MSLN两者联合预测需治疗ITP的发生有较高价值,有望成为预测需治疗ITP发生的生物学指标。

综上所述,ITP患者血清miR-4731-5p水平降低,MSLN水平升高,且两者与PLT、MPV密切相关,对需治疗ITP的发生有较高预测价值。然而,本研究纳入的病例数较少,且未深入探究miR-4731-5p、MSLN导致PLT破坏增加及生成不足的具体作用机制,未来将扩大样本量深入探究两者引起PLT减少的作用机制。