IL-33通过调节NF-κB信号通路促进肝癌细胞增殖和迁移

赵盈 田明

目前认为炎症是癌症的标志,在肿瘤发生的不同阶段起着决定性作用,IL-33是IL-1细胞因子家族的成员,坏死细胞的被动释放是细胞外IL-33出现的主要机制[1]。IL-33可能充当细胞受损或机械损伤后在细胞外释放的警报信号,以提醒免疫系统细胞或组织受损[2]。研究显示,IL-33通过促进固有淋巴样2型细胞(ILC2)的活化和增殖及诱导Th2细胞的产生等机制加剧肝脏的纤维化,可导致肿瘤细胞增殖和炎性介质的产生,包括IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等释放[3,4]。NF-κB蛋白复合物被认为是炎症反应的主要调节剂,其长期或失控的激活是炎性疾病的标志,并且可以通过激活炎症和增殖等相关基因来促进肿瘤发生[5]。本研究探讨IL-33是否通过NF-κB信号通路介导肝癌细胞分泌验证因子,从而影响肝癌细胞增殖和迁移。

材料与方法

一、主要试剂与器材

LO2、MHCC97H、LM3、HepG2、SMCC7721、Hep3B细胞株购自上海ATCC细胞库,RPMI1640、DMEM、胰蛋白酶及胎牛血清购自美国Gibco公司,细胞培养瓶、板和皿均购自美国Corning公司,人重组IL-33购自美国PeproTech公司,NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB抗体及二抗购自美国Santa Cruze公司,IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18ELISA试剂盒购自美国R&D有限公司,EdU细胞增殖试剂盒购自上海碧云天生物有限公司,CCK8试剂盒购自日本Dongjun有限公司,反转录和扩增试剂盒购自日本TakaRa公司。荧光定量PCR(RT-PCR)引物由上海生工有限公司合成。多功能酶标仪购自德国Berthold Technologies公司,垂直电泳仪购自BioRad公司,PCR仪购自美国ABI公司。

二、细胞培养

将几种细胞系分别培养于37 ℃、体积分数为0.05的CO2细胞培养箱内,培养液为含10%胎牛血清的RPMI1640及DMEM培养基,0.25%胰蛋白酶消化传代,倒置光学显微镜下观察细胞生长状态。

三、CCK8 法测定HepG2 细胞活力

取对数生长期HepG2 细胞,制备单细胞悬液,以5×104个/mL细胞接种于96 孔培养板中,培养24 h 后加入IL-33(10 ng/mL),培养24 h及48 h后,每孔加入10 μL的CCK8溶液,4 h后终止培养,酶标仪读取450 nm下的吸光度(A)值,根据公式计算细胞活力。细胞活力*(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(未加药)-A(空白)]×100。实验重复3次。

四、EdU实验观察HepG2 细胞增殖

取对数生长期HepG2细胞,制备单细胞悬液,以5×104个/mL 的细胞接种于96孔培养板中,培养24 h后加入IL-33(10 ng/mL),培养24 h后,按照EdU试剂盒说明书进行检测,每组设置5个复孔。

五、RT-PCR检测不同肝癌细胞中IL-33的表达

收集IL-33处理24 h组与对照组的HepG2 细胞,按试剂盒说明书提取总mRNA,再根据试剂盒说明书进行逆转录和扩增。GAPDH 上游引物:5′-GTTCGACAGTCAGCCGCATC-3′,下游引物:5′-GGAATTTGCCATGGGTGGA-3′;IL-33上游引物:5′-TTATGAAGCTCCGCTCTGGC-3′,下游引物:5′-CCAAAGGCAAAGCACTCCAC-3′,结果以2-ΔΔCT表示。

六、蛋白质印迹检测IL-33对HepG2 细胞NF-κB信号通路的影响

收集IL-33处理24 h组与对照组的HepG2 细胞提取蛋白,经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,按照恒流电流350 mA转移至PVDF 膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h 后,加1∶1 000稀释的NF-κB、p-NF-κB、IκB、p-IκB一抗4℃孵育过夜,封闭液漂洗后加入1∶5 000稀释的二抗室温孵育2 h,漂洗后ECL检测,曝光、显影。采用图像分析系统检测各条带的吸光度,以目的条带与内参吸光度的比值作为相对表达量。实验重复3次。

七、Transwell小室和划痕实验检测IL-33对HepG2 细胞迁移的影响

培养HepG2细胞,长至50%～60%,IL-33处理继续培养24 h;用胰酶消化细胞,将混悬有细胞的培养基种入上小室内,下小室加入含10%血清的培养基,继续在孵育箱中培养24 h。吸去每个小室内培养液,加4%多聚甲醛固定10 min(液体覆盖底部)。每个小室加入双蒸水洗涤2 min,换新鲜双蒸水再次洗涤2 min。按5×结晶紫染色液∶稀释液=1∶4配制结晶紫溶液,吸去洗涤液,加入结晶紫染色10 min(可根据染色结果和要求调整时间),蒸馏水洗涤充分(不要擦去小室底部细胞),显微镜下观察细胞迁移情况、拍照。

培养HepG2细胞于六孔板内,长至50%～60%,用枪头垂直于小孔划一道线,光学显微镜下观察0 h时划痕情况,显微镜下拍照。IL-33处理继续培养观察24 h后划痕情况,显微镜下拍照。

八、统计学分析

结 果

一、不同肝癌细胞中IL-33 mRNA相对表达情况

IL-33 mRNA相对表达情况分别为LO2(1.01±0.01)、MHCC97H(1.08±0.05)、LM3(1.76±0.21)、HepG2(3.88±0.35)、SMCC7721(2.24±0.43)和Hep3B(2.13±0.30),差异有统计学意义(F=19.621,P=0.001)。

二、HepG2细胞中NF-κB、p-NF-κB、IKB、p-IKB的蛋白相对表达情况

IL-33处理24 h组中NF-κB磷酸化蛋白及IKB磷酸化蛋白相对表达水平均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 HepG2细胞中NF-κB、p-NF-κB、IKB、p-IKB的蛋白相对表达情况(±s)

三、HepG2细胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18因子情况对比

IL-33处理24 h组中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18因子水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 HepG2细胞中IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18表达情况对比(±s)

四、HepG2细胞增殖及活力情况对比

IL-33处理24 h组细胞增殖为(1.41±0.08)、24 h细胞活力为(135.69±6.88)%、48 h细胞活力为(176.34±25.69)%,均高于对照组的(0.86±0.04)、(98.65±1.05)%、(119.89±10.86)%,差异有统计学意义(t=13.750、9.218、3.506,P=0.017)。

五、HepG2细胞侵袭和迁移情况对比

Transwell小室和划痕实验结果发现,IL-33处理24 h组细胞侵袭数量(256.38±10.11)个、迁移相对距离(0.74±0.05),高于对照组的(185.63±23.54)个、(0.45±0.12),差异有统计学意义(t=4.783,P=0.005;t=3.864,P=0.012)。

讨 论

肿瘤微环境浸润的炎性免疫细胞为肿瘤细胞提供了有利的炎性微环境,促进肿瘤细胞的血管生成、转移侵袭[6-8]。IL-33是IL-1细胞因子家族的成员,是IL-1受体家族的抑制致瘤性2(ST2)受体的唯一配体[9]。IL-33合成后,胞质IL-33易位至细胞核,与染色质结合,IL-33的N末端结构域包含一个核定位序列和一个染色质结合结构域,是其核易位的关键[10]。IL-33 通过其ST2激活PLD/SPHK-NF-κB 和MAPK-ERK/P38/JNK 等信号通路诱导了多种炎症性疾病的病理过程,引发TH2型免疫应答,刺激TH2型细胞因子的分泌,参与了过敏性疾病、组织损伤修复、炎症及肿瘤等多种疾病生理过程。NF-κB是存在于细胞内的一种重要核转录因子,具有调节炎症、胚胎发育、组织损伤和修复等生物行为相关基因表达的功能。研究表明,NF-κB是一大家族,由NF-κB 1 (P50及其前体P105)、NF-κB 2(P52及其前体P100)、P65(Rel A)、Rel B和c-Rel组成[6]。正常情况下,NF-κB在细胞内是以非活性的三聚体状态存在,三聚体由NF-κB两成员单体、抑制因子IKB(分为IKB和IKBβ两个亚单体)结合而成。在细胞因子、内毒素或活性氧簇等因素刺激下,IKK(IKB激酶)就会磷酸化IKB的丝氨酸残基(特殊位点上),后者被泛素化并被26S的蛋白酶体降解[11]。IKB一旦被降解,不再受限制的NF-κB就获得活性移位至细胞核内,结合到相应的DNA序列,进而启动靶基因的转录。而NF-κB信号传导的激活,将进一步增强局部炎症的发生[12]。

IL-33已被证明是急慢性肝衰竭、肝硬化以及慢性乙型肝炎病毒感染或丙型肝炎病毒感染的诱导因子[13]。但是,尚不清楚释放的IL-33在HCC发展中的功能。研究中IL-33 mRNA在几种肝癌细胞中均高表达(LM3、HepG2、SMCC7721和Hep3B),使用外源性IL-33细胞因子处理肝癌细胞HepG2,发现IL-33诱导HepG2细胞中NF-κB信号传导的激活,促进HepG2细胞中炎症因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18)释放,促进肝癌细胞增殖和迁移。

综上所述,IL-33可以促进肝癌细胞的增殖和迁移,同时影响细胞的炎症水平并激活NF-κB 信号通路。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。