HS-SPME-GC-MS 结合OAV 分析不同产地青花椒浸提前、后的关键香气成分

周志帅，李 娇，林德贤，何 利*

（1 四川农业大学食品学院 四川雅安625014 2 江西百草园实业有限公司 南昌 330096）

花椒是一种小树或大灌木，高达6 m，枝无毛，果实是一种小核果，卵形，成熟时分裂成两半，含有单一圆形和闪亮的黑色种子，大小为2～3 mm，多被栽培于亚热带至温带喜马拉雅山脉（克什米尔至不丹）、印度东北部、巴基斯坦、泰国、日本、朝鲜、韩国、越南北部等国家和地区，在中国主要分布在南方海拔800 m 以下的温暖地区，如广西、广东、贵州、云南、福建、台湾和四川等[1-2]。青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.）为木兰纲（Magnoliopsida）无患子 目（Sapindales）芸香科（Rutaceae）花椒属（Zanthoxylum）崖椒亚属（Zanthoxylum Subgen）植物的果实，是我国最常用的“八大调料”之一[3]。现代研究表明，青花椒具有抗氧化和抗糖基化等特性[4]，也有抗炎、镇痛、抑菌等药理作用[5]。

青花椒作为调味料，除了以完整或粉末形式食用外，还被加工成花椒油，以保留花椒原有的香麻滋味，减少花椒在贮藏、销售过程中有效成分的损失。目前，花椒油的加工方法以植物油热浸提法为主，然而该方法会产生油脂总质量5%～10%的加工副产物[6]。业界将这些副产物称为花椒残渣，除极少部分用作肥料或饲料外，绝大部分被直接废弃，造成了极大的资源浪费[7]，而在国外，油脂工业总产值的三分之二来源于原料制油后的副产物[8]。王春霞等[8]研究表明藤椒冷榨油饼粕中总酚含量可达（6.83±0.09）mg/g，具有一定的抗氧化活性。姜欢笑[9]研究发现藤椒冷榨油饼粕中含量最高的是粗纤维，为54.87%，粗脂肪及粗蛋白的含量分别为11.73%和8.07%。Xu 等[10]研究显示花椒残渣中含有较多的单糖，如L-鼠李糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-（-）-阿拉伯糖。蒋凌燕等[11]提取花椒残渣中的花椒油树脂，其麻度等级可达到6 级。这些研究均表明花椒残渣具有较大的再利用价值。目前，对花椒残渣中的挥发性香气成分残留的研究还鲜有报道，从残渣中提取相应成分的理论依据尚不充足，采用气-质谱联用仪可对样品中挥发性香气成分进行检测，通过定性、定量检测分析能准确的得出样品之间的挥发性香气成分的差异[12]。

基于此，本研究选择西南片区5 个产地青花椒及利用菜籽油加热浸提后分离得到的青花椒残渣为试验对象，采用GC-MS 对不同产地原青花椒及其残渣中挥发性风味成分进行检测，并利用聚类热图、气味活度值（Odor activity value，OAV）、韦恩图、主成分分析（Principal component analysis，PCA），对原青花椒及其残渣的挥发性物质进行分析，以期确定不同产地原青花椒及其残渣中的关键香气成分，并探索基于关键香气成分对不同产地原青花椒及其残渣进行区分的可行性，为花椒油生产企业对原料的选择及青花椒残渣的综合利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试的四川汉源干品青花椒、四川洪雅干品青花椒、四川金阳干品青花椒、重庆江津干品青花椒、云南昭通干品青花椒，四川友嘉食品有限公司。分析中的原青花椒分别标记为GSP-No.1、GSP-No.2、GSP-No.3、GSP-No.4、GSP-No.5，残渣分别标记为LR-No.1、LR-No.2、LR-No.3、LR-No.4、LR-No.5。

甲醇，成都市科隆试剂有限公司；1-2 二氯苯，上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

RC20002 电子天平，四川聚优格商贸有限公司；ESJ220-4B 分析天平，沈阳龙腾电子有限公司；7890B-5977B 型气质联用仪，美国安捷伦科技有限公司；FW-100 高速万能粉碎机，北京中兴伟业世纪仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 浸提前样品制备：用粉碎机将青花椒粉碎至40～60 目；浸提后样品制备：精确称取青花椒50 g，一级菜籽油450 g。将青花椒∶冷水按质量比1∶2 复水30 min，过滤，取滤渣于130 ℃（菜籽油）条件下，浸提10 min，过滤后将残渣以3 000 r/min 离心5 min 后，将残渣用粉碎机粉碎至40～60 目，待用。所得样品于-18 ℃保存。

1.3.2 样品挥发性风味物质检测

1）固相微萃取（SPME）处理 参考陆占国等[13]的方法并稍加修改，准确称取0.2 g 样品（精确到0.0001 g），加入60 μL 质量浓度为0.1306 mg/mL 的1，2-二氯苯内标溶液（溶于甲醇）于20 mL 顶空瓶中且用聚四氟乙烯/硅橡胶隔垫密封，置于60 ℃水浴中平衡30 min，插入50 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，60 ℃吸附30 min 后，插入气质联用仪解析5 min。

2）气相色谱-质谱测定条件 色谱条件：色谱柱DB-WAX UI，进样口温度：250 ℃；联接线温度：250 ℃；载气：He；进样模式：不分流进样；载气流速：1.0 mL/min，升温程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min 升到120 ℃，以2.5 ℃/min 升到150 ℃后保持5 min，以10 ℃/min 升到230 ℃后保持10 min。

质谱条件：离子源类型：EI；发射能量：70 eV；离子源温度：230°C；四极杆温度：150 ℃。

3）挥发性香气成分的定性与定量分析 通过计算机NIST11L 谱库和人工检索处理，参考相关文献定性鉴定检出成分，统计匹配度大于80（最大值100）的组分，以邻二氯苯为内标进行半定量分析，按式（1）计算含量。

式中，Ci——目标物质含量（mg/g），Ai——目标化合物峰面积；As——内标物峰面积；Cs——内标物浓度（mg/mL）；Vs——内标物添加体积（μL）；m——样品质量（g）。

1.3.3 关键香气成分分析 根据内标法对不同样品中各挥发性成分进行的定量分析结果和各挥发性成分在水中的嗅觉阈值，按照式（2）计算气味活度值（OAV，OAV≥1.0 为关键风味物质，0.1≤OAV〈1.0 为修饰性风味物质，OAV〈0.1 为潜在修饰风味物质）[14]。

式中，c——化合物的绝对含量（mg/kg）；OT——该化合物在水溶液中的嗅觉阈值（mg/kg）。

1.4 数据处理

采用SPSS 22.0 和Microsoft Excel 2010 进行数据处理和分析，用Origin 2021 绘图。

2 结果与分析

2.1 原青花椒及其残渣挥发性风味成分解析

5 种原青花椒及其残渣共10 个样品经GCMS 分析，共检出51 种（12 个共有组分）香气成分，包括烯烃类（20 种）、醇 类（15 种）、酯 类（3种）、酮类（2 种）、烷烃类（5 种）、酸类（2 种）、酚类（1 种）、醛类（1 种）、其它类（2 种）。总体来看，在10 个样品中，挥发性香气成分的种类和含量最多的均为烯烃类和醇类化合物，其均值分别为59.38%和36.77%，这与赵静珂等[15]的研究结果一致。原青花椒中烯烃类含量为65.53%，73.31%，62.33%，66.13%，63.33%，残渣中烯烃类含量均低于平均值，其中LR-No.2 为58.99%，原青花椒中醇类为28.97%，24.64%，31.42%，30.38%，31.21%，残渣中醇类含量均高于平均值，其中LR-No.3 为47.61%。不同产地原青花椒中的挥发性风味成分存在差异，这可能是由于地理区域之间存在差异，在一定程度上导致青花椒的香气特征不同[16]，因此经过油脂浸提后的青花椒残渣中的挥发性香气成分也存在一定差异。

由图1 可知，原青花椒及其残渣中的挥发性风味成分种类基本一致，其中烯烃类约占总数的1/4，醇类约占总数的1/7，这和Liu 等[17]及杨静等[18]的研究结果类似。其中，四川金阳干品青花椒（GSP-No.3）中的挥发香气成分的种类最为丰富，然而经过油脂浸提后，云南昭通干品青花椒残渣（LR-No.5）中挥发性香气成分种类最为丰富。

图1 原青花椒及其残渣的挥发性风味成分种类数Fig.1 Number of volatile compounds in green Sichuan pepper and their leaching residue

由图2 可知，原青花椒中，烯烃类约为醇类含量的1 倍。GSP-No.2 烯烃类和醇类含量最高，为10.1258 mg/g 和3.4026 mg/g。GSP-No.1 和GSPNo.3 中分别检出醇类物质2.4977 mg/g 和2.4182 mg/g，LR-No.1 和LR-No.3 中分别检出2.8252 mg/g 和3.1774 mg/g，残渣中的醇类物质上升了13.11%和31.39%；GSP-No.1 和GSP-No.3 中分别检出酸类物质0.0065，0.0097 mg/g，LR-No.1、LRNo.3 中分别检出0.0108 mg/g 和0.0119 mg/g，残渣中的酸类物质上升了66.15%和22.58%。在5 个产地的青花椒残渣中，醇类物质的含量有所增加，主要原因可能是原青花椒在热油浸提之前用水浸泡过，烯烃类物质在水溶液中发生加成反应转化生成了一部分醇类物质[12]，而整体的风味成分含量较原青花椒有所下降，这可能是由于浸提的温度导致风味成分损失，造成部分成分含量减少[19]。

图2 原青花椒及其残渣的挥发性风味成分绝对含量Fig.2 The absolute content of volatile flavor compounds in green Sichuan pepper and their leaching residue

图3 是不同产地原青花椒及其残渣中的挥发性风味成分的聚类热图，将挥发性风味成分的检测数据可视化，红色代表同种物质的含量低，蓝色则代表该物质的含量高。在10 个样品中，桧烯、（+）-柠檬烯、芳樟醇、月桂烯是主要的化合物，而十四烷、（1S）-6，6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-烯-2-基甲醇乙酸酯、2，6-二甲基癸烷、苯甲醇等是含量最低的化合物。通过聚类分析可以看出，不同产地原青花椒及其残渣在挥发性风味成分组成及含量方面具有差异性和相似性，其中GSP-No.1、GSPNo.3、GSP-No.4、GSP-No.5 原青花椒具有一定的相似性，GSP-No.2 的挥发性风味成分与其它4 个产地原青花椒存在明显差异；5 个产地的青花椒残渣具有一定的相似性，而LR-No.2 和LR-No.3与原青花椒的相似程度更高，说明LR-No.2 和LR-No.3 青花椒残渣挥发性香气成分保留较好。

图3 原青花椒及其残渣GC-MS 测定结果热图Fig.3 Heat map display of green Sichuan pepper and their leaching residue

2.2 原青花椒及其残渣关键香气成分分析

挥发性风味成分是否对整体的香气有显著的贡献，取决于两个因素，即挥发性风味成分的浓度及其气味阈值。OAV 是确定GC-MS 鉴定出的化合物对样品香气有贡献的重要方法，一般来说，含有OAV≥1 的化合物被认为是关键的芳香化合物[20]，而OAV〈1 的化合物被认为对香气的贡献较小[21]。通过已明确的香气成分阈值，确定了青花椒及其残渣中OAV≥1 的22 种关键香气成分，赋予了原青花椒及其残渣典型的青花椒香气，阈值及香气描述[18，22-31]如表1 所示，成分主要为烯烃、醇类，另外还有酯类、烷烃类、酸类和酚类等，该结果与Jiang 等[32]的研究结果一致。由表2 可以看出，芳樟醇在原青花椒5 个样品中均存在，其气味活度值最大，对香气贡献程度最大，芳樟醇是由芳樟醇合成酶从香叶酰焦磷酸前体中释放出来的[33]，具有甜香和果香，赋予青花椒清香的风味，是原青花椒中主要的挥发性风味成分[34]；其次是月桂烯，OAV〉1 000 的香气物质还有（+）-柠檬烯、反式石竹烯、罗勒烯和桧烯，1〈0AV〈1 000 的香气物质有松油烯、γ-松油烯、萜品油烯、乙酸芳樟酯和十四烷，对青花椒的香气呈现有一定的贡献。在青花椒残渣的5 个样品中均存在且对香气贡献程度最大的也是芳樟醇，其次是月桂烯，其中OAV〉1 000的香气物质还有（+）-柠檬烯、反式石竹烯、乙酸；1〈0AV〈1 000 的香气物质有桧烯、松油烯、罗勒烯、γ-松油烯、萜品油烯和乙酸芳樟酯。可以看出，青花椒经热油浸提后，其中的关键香气成分种类出现一定的变化，造成表达出可识别的香气发生改变，但在原青花椒及其残渣10 个样品中，OAV均大于1 000 的关键香气成分均有芳樟醇、月桂烯、（+）-柠檬烯和反式石竹烯4 种，对青花椒香气贡献较大，该结果与Ji 等[35]的研究结果类似，这些香气成分也是花椒残渣中主要的呈香物质，与陈海涛等[36]的研究结果类似。

表1 不同产地原青花椒及其残渣特征香气成分的阈值及其嗅觉描述Table 1 Thresholds and olfactory description of green Sichuan pepper and their leaching residue from origins

表2 不同产地原青花椒及其残渣特征香气成分OAVTable 2 OAV of green Sichuan pepper and their leaching residue from origins

由图4a 可知，5 个产地原青花椒中，共确定的关键香气成分分别为16，15，16，16，16 种，其中11 种共有关键香气成分，GSP-No.1 特有关键香气成分1 种，为茴香脑；GSP-No.3 特有关键香气成分1 种，为橙花叔醇；GSP-No.5 特有关键香气成分1 种，为蒎烯；由图4b 可知，5 种青花椒残渣中，共确定的关键香气成分分别为15，13，13，14，16 种，其中11 种共有关键香气成分，LR-No.1 特有关键香气成分1 种，为4-乙烯基-2-甲氧基苯酚；LR-No.3 特有关键香气成分1 种，为（-）-4-萜品醇；LR-No.5 特有关键香气成分1 种，为十四烷。通过查询关键香气物质化学结构式可以看出，这些香气物质多数含有C=C 或C=O 双键结构，这种双键结构可能对原青花椒及其残渣的呈香品质具有重要作用[37]。

图4 原青花椒（a）及其残渣（b）关键香气成分Venn 图分析Fig.4 Venn diagram analysis of green Sichuan pepper and their leaching residue（b）

2.3 原青花椒及其残渣中关键香气物质PCA分析

10 个样品的关键香气成分分别映射在4 个象限上，在第一象限中，PC1〉0、PC2〉0；第二象限中，PC1〈0，PC2〉0；第三象限中，PC1〈0，PC2〈0；第四象限中，PC1〉0，PC2〈0。

由图5a 可知，原青花椒关键香气主成分分析中，PC1 和PC2 的贡献率分别为48.7%和31.4%，基本可以反映出大部分原始数据的变异信息[38]。5个产地原青花椒分布在3 个象限中，GSP-No.1、GSP-No.3 和GSP-No.4 在PCA 图的第三象限内，这一象限主要反映了O3（水芹烯）、O20（乙酸）、O13（4-萜烯醇）、O14（橙花叔醇）、O22（茴香脑），从OAV 值可以看出，这些关键香气成分对青花椒的香气贡献较小，说明这3 个产地的青花椒特征风味相对不强；GSP-No.2 在PCA 图的第四象限内，这一象限主要反映了O1（桧烯）、O2（月桂烯）、O5（（+）-柠檬烯）、O6（罗勒烯）、O9（反式石竹烯）、O11（芳樟醇）、O16（α-松油醇），从OAV 值可以看出，这些关键香气物质对青花椒的香气贡献较大，说明GSP-No.2 青花椒的特征风味较强；GSP-No.5 在PCA 图的第一象限内，这一象限主要反映了O4（松油烯）、O7（γ-松油烯）、O8（萜品油烯）、O10（蒎烯）、O15（4-萜烯醇）、O18（水杨酸甲酯）、O19（十四烷），从OAV 值可以看出，这些关键香气物质对青花椒的香气贡献程度居中，说明GSP-No.5青花椒的特征香气强度在GSP-No.2 与GSP-No.1、GSP-No.3、GSP-No.4 3 个产地之间。

图5 原青花椒（a）及其残渣（b）关键香气成分PCA 分析Fig.5 Principal component analysis of green Sichuan pepper（a）and their leaching residue（b）

由图5b 可知，原青花椒关键香气主成分分析中，PC1 和PC2 的贡献率分别为42.5%和31.5%，基本可以反映出大部分原始数据的变异信息。LR-No.1 在PCA 图的第一象限内，这一象限主要反映了O3（水芹烯）、O4（松油烯）、O8（萜品油烯）、O13（4-萜烯醇）、O18（水杨酸甲酯）、O21（4-乙烯基-2-甲氧基苯酚）、O22（茴香脑），从OAV值可以看出，这些关键香气物质对青花椒残渣的香气贡献程度适中，说明LR-No.1 残渣具有一定的青花椒特征香气；LR-No.2 在PCA 图的第二象限内，这一象限主要反映了O1（桧烯）、O2（月桂烯）、O5（（+）-柠檬烯）、O6（罗勒烯）、O9（反式石竹烯），从OAV 值可以看出，这些关键香气物质对青花椒残渣的香气贡献较大，说明LR-No.2 青花椒残渣的特征风味比LR-No.1 强；LR-No.3 在PCA图的第三象限内，这一象限主要反映了O11（芳樟醇）、O15（4-萜烯醇），从OAV 值可以看出，O11（芳樟醇）对青花椒残渣的香气贡献较大，达到了497 450，而O15（4-萜烯醇）未在该样品中检出，说明LR-No.3 的青花椒香气非常浓郁；LR-No.4 和LR-No.5 在PCA 图的第四象限内，这一象限主要反映了O16（α-松油醇）、O17（乙酸芳樟酯）、O20（乙酸），从OAV 值可以看出，这几个关键香气物质对青花椒残渣的香气具有一定的作用，然而种类单一，且合计OAV 值较小，因此LR-No.4 和LR-No.5 两个产地的青花椒残渣的特征香气可能与LR-No.1 较为接近，与LR-No.3 和LR-No.2 的香气差异较大。PCA 结果与聚类热图分析互为补充，分析结果基本一致，表明关键的香气成分能够准确地表征样品的风味属性，是导致原青花椒及其残渣特性和差异的关键芳香活性化合物[39-41]。

3 结论

通过气相色谱-质谱联用技术，对5 个产地原青花椒及其残渣的挥发性风味成分进行定性、定量分析，比较发现原青花椒及其残渣的挥发性成分虽然在种类和含量上存在一定差异，但主要成分是相似的。通过OAV 分析，确定了对原青花椒及其残渣香气起重要作用的22 种关键香气成分为芳樟醇、月桂烯、（+）-柠檬烯、反式石竹烯、罗勒烯、桧烯、松油烯、γ-松油烯、萜品油烯、乙酸芳樟酯等，这与花椒的特征挥发性风味成分一致。经过热油浸提后青花椒残渣依然保留了原青花椒的主要关键香气成分，关键香气成分的变化主要表现在烯烃类物质含量减少，醇类物质含量增加，进一步分析表明：5 个产地原青花椒中，四川洪雅干品青花椒（GSP-No.2）的关键香气成分更丰富，是较为理想的花椒油浸提用原料，四川洪雅青花椒残渣（LR-No.2）和四川金阳青花椒残渣（LR-No.3）的关键香气成分较丰富，有一定的利用价值，为残渣的综合利用提供了参考。