基于蛋白质/肽组学的三文鱼物种溯源

蒋冰雪，张晓梅，丁 矛，王 萍，张鸿伟*，陈桂东*

（1 中国海洋大学食品科学与工程学院 山东青岛266003 2 青岛海关技术中心 山东青岛266114 3 青岛海关风险防控分局 山东青岛 266114）

三文鱼 是鲑形 目（Salmoniformes），鲑 科（Salmonidae）鱼类的商品名，生长在高纬度冷海水域，其肉色呈橘红色，肉质鲜美，被誉为“冰海之皇”[1]。目前，消费量最大的三文鱼有大西洋鲑鱼（Salmo salar）、大马哈鱼（Oncorhynchus keta）和虹鳟（Oncorhynchus mykiss）。其中，大西洋鲑鱼为鲑属（Salmo），口感鲜美且富含多种氨基酸和不饱和脂肪酸，被誉为“鱼中至尊”；大马哈鱼和虹鳟同为大马哈鱼属（Oncorhynchus），肉质较为粗糙，且生产成本低，市场价值与大西洋鲑鱼相差甚远[2]。经过加工切片的3 种鱼肉在外观上均为白橘相间，消费者很难凭肉眼辨别。受利益驱使，市场上时常出现将大马哈鱼和虹鳟鱼贴签大西洋鲑鱼的现象[3-4]。

目前针对大西洋鲑鱼、大马哈鱼和虹鳟鱼物种鉴别的技术手段，大多是通过分子生物学和光谱法[5-6]，特别是DNA 分析技术最为常见[7]。Rasmussen 等[8]对种商业鲑鱼和鳟鱼进行DNA 测序，确定细胞色素c 的标准650 bp 条形码区域氧化酶亚基Ⅰ基因（COI）可用于区分三文鱼物种。之后，团队又开发一种基于COI DNA 条形码序列的物种特异性多重PCR 方法，用于快速鉴别三文鱼种属[9]。Li 等[10]采用环介导的等温扩增技术并结合自猝灭荧光方法进行三文鱼的物种鉴定。然而，DNA 分析不适合深加工食品样本多通道并行的分析。随着质谱-组学技术的快速发展，具有多目标高通量、高选择性和高灵敏度等特点的质谱分析，作为一种可选技术在物种鉴别领域得到推广应用和发展[11]。Yu 等[12]采用亲水相互作用色谱串联质谱法建立脂质组学方法，通过统计分析揭示帝王鲑（Oncorhynchus tshawytscha）、大西洋鲑和虹鳟之间的磷脂分子种类差异，结果确定m/z 802.8 和m/z 834.8 的磷脂分子可作为物种标志物。同样，蛋白质作为食品中重要的营养组分，基于质谱平台的蛋白质/肽组学近些年也成为食品物种鉴别的分析手段之一，广泛应用于肉类[13-15]、谷物[16]、水产品[17-19]、乳制品[20]、石斛[21]、燕窝[22]等食品的物种溯源分析。数据依赖型采集（Data dependent acquisition，DDA）可将理论肽段序列直接和实际谱图匹配，得到蛋白质和肽段的鉴定信息。基于全理论碎片质谱离子连续窗口采集模式（Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra，SWATH-MS）的高分辨质谱蛋白组学分析可用于目标样本的特征肽段筛查，基于特征肽段的多反应监测（Multiple reaction monitoring，MRM）采集模式的串联四极杆质谱肽组学分析可用于更精准的定性、定量分析[23-24]。两者的结合使用可有效实现食品的物种溯源。Qiu 等[25]基于鸟枪法蛋白质组学和MRM 肽组学分析方法，对非可食动物和可食肉动物进行研究，得到9 种肽作为区分物种的标志物，以及能用于区分皮毛动物非食用肉的特征肽段。Fornal 等[26]通过高分辨质谱寻找特征肽段，并利用三重四极杆质谱建立准确区分鸡、鸭、鹅种家禽肉类的基于特定肽段的MRM 分析方法。

本研究基于超高效液相色谱-四极杆飞行时间（Ultrahigh-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight，UHPLC-Q/TOF）质谱和超高效液相色谱-串联四极杆质谱（UHPLCtandem quadrupole mass spectrometry，UHPLCQqQ）的蛋白质组学/肽组学分析策略，结合生物信息学工具筛选大西洋鲑鱼、大马哈鱼和虹鳟鱼潜在的物种特征肽段，建立基于MRM 的鉴别分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大西洋鲑鱼（Salmo salar）、大马哈鱼（Oncorhynchus keta）购于青岛麦德龙超市，具有麦哲达产品追溯二维码；虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）购于青岛共和县龙羊峡养殖基地。所有样品均经过相关形态学鉴定。

LC-MS 级乙腈，德国Merck 公司；LC-MS 级甲酸，美国Sigma 公司；碘代乙酰胺（Iodoacetamide，IAA）和二硫 苏糖醇（Dithiothreitol，DTT），北京索莱宝公司产品；尿素和碳酸氢铵，国药集团化学试剂公司；测序级胰蛋白酶（比活18 523 U/mg），美国Promega 公司。

1.2 仪器与设备

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理 三文鱼样品清理鱼骨和鱼皮，液氮浴研磨成粉。蛋白质提取参考等[27]和Zhang 等[28]方法。取2 g 样品，加入20 mL蛋白提取液（8 mol/L 尿素和50 mmol/L 碳酸氢铵），垂直振荡，离心取上清。取400 μL 上清液于分子质量10 ku 截留超滤离心管（Millipore，爱尔兰），分别加入8 μL 1 mol/L DTT，于60 ℃静置反应1 h。待温度降至常温，加入40 μL 1 mol/L IAA，室温避光1 h。12 000×g 离心20 min 后，加入200 μL 50 mmol/L 碳酸氢铵溶液离心以冲洗膜上蛋白，重复3 次。再加入200 μL 碳酸氢铵溶液作为缓冲液，按照酶与底物质量比1∶50 加酶，37 ℃下酶解16 h。12 000×g 离心20 min 收集膜下肽段待测。

1.3.2 UHPLC-Q/TOF 分析 色谱条件：色谱柱为Agilent Advance Bio Peptide Plus C18column（150 mm×2.1 mm，130 Å，2.7 μm）；流动相A 0.1%甲酸-水，流动相B 0.1%甲酸-乙腈，流速0.25 mL/min，洗脱梯度：0～2min，5%B；2～27 min，5%～20%B；27～37 min，20%～35%B；37～39 min，35%～80%B；39～42 min，80%B；42～46 min，5%B。进样量40 μL，柱温40 ℃。

DDA 分析参数：DuoSprayTM离子源，电喷雾正离子模式（ESI+）；喷雾电压5 500 V；质谱TOF 质荷比（m/z 扫描范围：350～1 500；碎片扫描触发条件：质荷比（m/z）扫描范围：350～1 200，强度阈值150 cps；质量精度阈值：50 mDa；碎片离子采集质荷比（m/z）扫描范围：100～1 500；每次采集循环中监测前20 个最强离子；选择高灵敏度模式：离子源参数条件：雾化气压力：413.7 kPa，辅助加热气压力：344.75 kPa，气帘压力：241.33 kPa，离子源温度525 ℃，解簇电压100 V，子离子扫描碰撞能量随着质荷比（m/z）动态变动。

SWATH-MS 分析参数：目标窗口数：60；质荷比范围：350～1350；碰撞能量扩展：15 V。进样量：30 μL，其色谱的参数条件与DDA 方法一致；质谱条件中除采集方法不同外，其参数设置与DDA 采集参数相同。

1.3.3 UHPLC-QqQ 分析 色谱条件：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18column（50 mm×2.1 mm，100 Å，1.3 μm）；流动相A 0.1%甲酸-水，流动相B 0.1%甲酸-乙腈，流速0.35 mL/min。洗脱梯度：0～10 min，10%～10.5%B；10～10.5 min，10.5%～45%B；10.5～13 min，45%～95%B；13～13.1 min，95%～10%B；13.1～15 min，10%B。柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子反应模式，检测方式MRM，喷雾电压5 500 V，离子传输管温度575 ℃；雾化气压力413.7 kPa，辅助加热气压力344.75 kPa，气帘压力241.33 kPa。

1.4 数据生物信息学分析

ProteinPilotTM软件（版本5.0.1，AB Sciex）用于蛋白质鉴定，蛋白信息数据库“Salmoniformes”下载于NCBI 网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），总条目数678 175（下载于2020 年7 月26 日）。PeakView 软件（版本2.1，AB Sciex）用于SWATHMS 数据分析；使用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）进行Venn 分析以寻找特征蛋白；Skyline 软件（版本3.7.0）用于预测MRM传输离子对。

2 结果与分析

2.1 蛋白质鉴定及潜在生物标志物的筛选

基于UHPLC-Q/TOF 采集的DDA 数据进行蛋白质鉴定在95%置信水平上鉴定到912 个蛋白质，13 615 个肽段，用于构建SWATH-MS 分析质谱库和划分SWATH-MS 采集窗口。大西洋鲑鱼、大马哈鱼和虹鳟鱼的鉴定结果见表1。

表1 三文鱼样本的蛋白质和多肽鉴定结果（95%置信水平）Table 1 Identification of proteins and peptides from salmon samples（Confidence 95%）

根据韦恩分析（图1），大西洋鲑鱼样本鉴定到特征蛋白质395 个，大马哈鱼样本鉴定到特征蛋白质269 个，虹鳟鱼样本鉴定到特征蛋白质218个。

图1 三文鱼样本蛋白质鉴定结果韦恩图Fig.1 Venn diagram of protein identification results of salmon samples

采用Peakview 软件对SWATH-MS 数据进行相对定量分析依据SWATH-MS 相关特征蛋白质的高分辨提取离子流（Extraction ion chromatograms，XIC）图和定量数据，选取无明显基质干扰、无检测交叉反应的肽段为初步筛选的物种特征肽段。

2.2 物种特征肽段筛选

使用初步筛选得到的物种特征肽段，在NCBI网站采用Blastp 检索进行物种特异性的数据库验证，将与备选的潜在特征肽段氨基酸序列100%匹配且对应物种具有唯一性作为肽段特异性筛选规则，得到备选大西洋鲑鱼特征肽段18 条，大马哈鱼特征肽段5 条，虹鳟鱼特征肽段10 条，详细见表2。

2.3 MRM 方法建立

采用skyline 软件预测上述筛选获得的备选物种特征肽段的MRM 传输离子对[29]，基于UHPLC-QqQ 质谱建立分析方法，优化分离梯度洗脱程序和流速确定相关肽段MRM 采集方法的最佳碰撞能量、解聚电压和保留时间。具体优化参数结果见表3。基于响应强度、交叉特异性和色谱峰形，最终筛选得到满足质谱鉴别的大西洋鲑鱼物种特征肽段10 条、大马哈鱼物种特征肽段2 条、虹鳟鱼物种特征肽段3 条，各物种特征肽段组MRM 提取离子流图，如图2、图3、图4 所示。

图2 大西洋鲑鱼物种特征肽段提取离子流图Fig.2 XICs of marker peptides of Salmo salar

图3 大马哈鱼物种特征肽段提取离子流图Fig.3 XICs of marker peptides of Oncorhynchus keta

图4 虹鳟鱼物种特征肽段提取离子流图Fig.4 XICs of marker peptides of Oncorhynchus mykiss

2.4 实际样品的验证

为进一步验证方法的适用性，使用建立的质谱鉴别分析方法对在青岛水产市场随机购买的三文鱼样品进行测定，结果表明市售样品1 含有大西洋鲑鱼全部特征肽段（图5），市售样品2（图6）含有虹鳟鱼全部特征肽段，图中红框表示鉴定到肽段。可能会出现类似肽段SAGEIEEYQR，有部分响应峰的假阳性现象，因使用肽段组进行物种判别更加稳定可靠。分析结果证明市场以三文鱼标识的售卖产品中确有不同的物种构成，提示建立相关鉴别分析方法的必要性。

图5 市售样品1 特征肽段的提取离子流图Fig.5 XIC of marker peptides for real-life sample 1

图6 市售样品2 特征肽段的提取离子流图Fig.6 XIC of marker peptides for real-life sample 2

此外，对购于青岛麦德龙超市（具有麦哲达产品追溯二维码）标识来自智利、丹麦、荷兰和挪威的大西洋鲑鱼产品，使用本试验建立的方法进行鉴别，结果显示相关产品均含有大西洋鲑鱼的相关特征肽段，表明方法不受样本产地的影响，进一步证明所建立的鉴别分析方法可靠。

3 结论

本研究基于UHPLC-Q/TOF 质谱的非靶向蛋白质组学研究，结合生物信息学方法，对大西洋鲑鱼、大马哈鱼和虹鳟鱼进行物种特征肽段的筛选，得到各物种的特征肽段共15 条，其中大西洋鲑鱼10 条、大马哈鱼2 条、虹鳟鱼3 条。通过靶向肽组学分析使用相应物种特征肽段，采用UHPLC-QqQ液质联用技术建立了MRM 快速鉴别方法，并通过实际样品分析结果显示方法准确可靠特异性好，适用性强，可作为现有DNA 分析技术方法的有效补充，适于实验室商品三文鱼种属的鉴别。