不同保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌S10 复配对发酵乳特性的影响

孙悦欣，史嘉琦，李 璟，刘俊霞，杨志辉，杨淑娟，白 梅，王记成，张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室 呼和浩特 010018）

自然发酵乳可以作为保加利亚乳杆菌特定的载体[1]。在发酵乳制品生产中，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）产生协同作用，是人体肠道内重要的微生物，因其较高的经济价值而受到广泛关注[2]。

大量研究探讨了保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在发酵乳中的应用，二者协同共生的关系可赋予发酵乳高黏度、快速产酸、丰富的活性物质等[3]。然而，有研究表明，只有一部分保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株间存在共生关系，除此之外两者间还可能具有拮抗作用[4]。由于保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的生长特性和代谢特性存在差异，不同菌株的组合对发酵乳的影响很大，甚至影响货架期稳定性。此外，乳酸菌之间也存在个体差异，如何筛选、搭配出相互促进的优良菌株组合仍有一定的难度。

保加利乳杆菌具有发酵时间短、后酸化弱、高产乙醛、双乙酰和生产应用稳定等特性，可增加发酵乳生产过程中的黏度。本研究团队从全基因组水平对保加利亚乳杆菌的遗传多样性和种群结构进行深入的群体遗传学研究，系统发育分析后将保加利亚乳杆菌划分为4 个分支谱系[5]。基于其高度的遗传多样性和分离源差异，推测菌株的多样性差异决定菌株具有不同的发酵表型。本研究采用的不同谱系的保加利亚乳杆菌IMAU20450 分离自蒙古国传统发酵酸牦牛乳，IMAU6209 和IMAU62161 分离自中国西藏地区酸马奶中，IMAU95110 分离自俄罗斯传统发酵酸牛乳。嗜热链球菌S10 分离自青海自然发酵酸牛乳中，具有产黏、产酸等优良发酵特性[6]。研究发现，与牛乳相比，在嗜热链球菌S10 发酵乳中鉴定出包括肽、氨基酸、脂肪酸及其相关代谢物和维生素等39 种重要的差异代谢物，其中发酵乳中月桂酸和维生素B2含量显著高于牛奶[7]。此外，嗜热链球菌S10 还可用作发酵豆乳的基础发酵剂，不仅具有较好的感官、发酵特性、贮藏特性，还具有较高的活性大豆异黄酮转化量，对调节女性体内雌激素水平具有很好的效果[8]。

扩散波谱技术（Diffusing-wave spectroscopy，DWS）是一种基于传统光散射的光学测量技术。其原理是样品内的随机运动的粒子对入射光子的多重散射，先得到被散射光子的自相关函数（即扩散波光谱），后通过计算机模拟，得到粒子的均方位移（MSD）、颗粒平均粒径及体系的流变参数[9]。在静止状态下与传统流变学相比，微流变学分析软物质的微观结构并不会破坏样品的凝胶结构，更不会对样品的状态产生影响[10]。对应用于发酵乳发酵过程中形成乳凝胶的特性分析具有独特优势。

本研究将4 株不同谱系的保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌S10 进行复配，以商业发酵剂为对照，分析发酵过程中微流变学特性，测定弹性因子（Elastic index，EI）、黏度因子（Viscosity index，VI）、固液平衡值（Solid liquid balance，SLB）及流动因子（Fluidity index，FI）随发酵时间的变化情况，对鉴别、控制发酵食品的质量具有重要的意义[11]。在贮藏期，通过稠度、硬度、内聚性和黏度指数评价发酵乳的质构特性，并对各组发酵乳的发酵和贮藏特性进行综合性评价。将具有优良发酵特性的不同保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌菌株进行组合，可提升发酵剂的整体性能[12]。筛选具有优良发酵性能的发酵剂组合，为生产优质发酵乳提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯牛乳（蛋白质3.0 g/100 g，脂肪3.0 g/100 g），蒙牛乳业；蔗糖，广西凤糖生化股份有限公司；菌株：保加利亚乳杆菌IMAU20450、IMAU95110、IMAU62091、IMAU62161 和嗜热链球菌S10 均来自内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室；商业发酵剂YF-L904（500U），科汉森公司。MRS 固体培养基、M17 固体培养基等试剂，青岛海博生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

试验所用仪器和设备信息见表1。

表1 主要仪器和设备信息Table 1 Information of the main instruments and equipment

1.3 试验方法

1.3.1 发酵乳的制备 发酵乳各组接种量如表2所示。发酵乳制作流程：牛乳中加入6.5%的蔗糖，预热至62 ℃，化料15 min，均质（20 MPa），95 ℃，5 min 杀菌，水浴冷却到42 ℃，接种发酵，pH 4.5 为发酵终点，水浴冷却到20 ℃以下，无菌分装。分装前进行破乳处理，于4 ℃储存21 d，25 ℃储存14 d，分别于1，3，7，10，14，21 d 进行相关参数的测定，每组3 个平行样。

表2 试验各组发酵乳接种量信息（CFU/mL）Table 2 Inoculation volume of each experimental fermented milk（CFU/mL）

1.3.2 发酵乳的感官评价 根据《食品安全国家标准发酵乳》（GB 19302-2010）[13]，选择6 位品评员对5 组发酵乳进行感官评价。取适量样品置于品尝杯中，在室温自然光下观察发酵乳的色泽、组织状态，闻其气味，品尝滋味。以酸奶的喜好程度进行排序。注意每次品尝完用温开水漱口，防止味道混淆。

1.3.3 发酵过程中微流变学特性分析 将接种后的20 mL 发酵乳转移至灭菌的微流变仪器配套样品瓶中，放入测定槽，提前将微流变仪温度调节至42 ℃，检测发酵过程中的MVI、EI、SLB 及FI 随时间的变化情况。发酵过程中每5 min 进行1 次数据采集，此过程一直持续到发酵终点[14]。

1.3.4 pH 值的测定 采用雷磁pH SJ-3F 型pH计测定，每个样品平行测3 次。

1.3.5 滴定酸度（TA）的测定[15]用电子天平准确称取10.0 g 发酵乳样品放入锥形瓶中，加入20 mL 去CO2的蒸馏水，摇匀，加入1 mL 酚酞指示剂，再次摇匀，用0.1 mol/L NaOH 滴定标准溶液至微粉色且5 s 内不消失即可。记录消耗的标准NaOH 溶液的体积（mL），每个样品平行测定3 次。

1.3.6 黏度的测定 将发酵乳样品置于100 mL烧杯中，室温下采用Brookfield DV-1 VISCOMETER 型黏度仪进行3 次平行样测定，发酵乳选取4#转子，转速100 r/min，扭矩10%～100%，测定时间30 s。

1.3.7 持水性的测定 取20 g 酸奶置于配有滤膜漏斗的250 mL 锥形瓶中，2 h 后将析出液倒出，再次称量样品和容器的质量，计算持水性。计算公式如下：

式中，m1——滤液质量（g）；m2——样品质量（g）。

1.3.8 质构特性的分析 A.XT plus 质构仪选用A/BE 探头。A/BE 探头是一种反向挤压装置。在进行下压试验时，样品从活塞的外缘被反向挤出，适用于本试验软凝胶类的黏性物质测定[16]。试验速度均固定到1 mm/s，穿透深度为30 mm。可检测发酵乳在1，7，14，21 d 的硬度、稠度、内聚性和黏度指数的变化情况。使用5 kg 的称重传感器进行单次压缩循环试验测量酸奶样品[17]。需注意的是样品在4 ℃取出后置室温，然后检测。

1.3.9 统计分析 微流变数据采用Rheolaser Master 型光学法微流变分析仪自带的Smart 软件进行数据分析。所有图表均采用Orgin 9.1 绘制。试验数据使用SPSS 25.0 软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 感官特性

评分细则见表3。将每组发酵乳样品按随机顺序给6 位品评员品尝，按照对5 组发酵乳的喜好程度进行排序，感官评价结果见表4。结果表明：对A、C 组的喜好程度明显大于其它发酵组。品评员普遍认为A、C 组发酵乳酸甜比恰当，组织均匀，质地细腻丝滑，品尝时无颗粒感，具有发酵乳特有的风味。

表3 感官评分表Table 3 Sensory score sheet

表4 感官评价结果Table 4 Sensory evaluation sheet

2.2 微流变学特性

在发酵过程中，各组发酵乳的凝胶化过程中微流变特性参数随发酵时间的变化情况如图1 所示。FI 值反映发酵乳中微观粒子的运动速度。FI值越高，运动速度越快，颗粒越多，流动性越大[18]。EI 直接反映弹性模量，EI 值越大，样品的凝胶结构越强，样品性质越稳定[19]。MVI 表示黏性模量，显示发酵乳黏度的变化[20]，MVI 与黏性模量成正比。SLB 直接反映产品偏固态或液态时与时间对应的函数关系，与黏弹性性能成正比，当0.5〈SLB〈1 时，表现出黏性模量，样品质地偏向于液态[19]。研究表明，酪蛋白胶束是凝胶形成的主要驱动力[21]。

图1 发酵乳在发酵过程中的弹性因子（a）、固液平衡值（b）、黏性因子（c）及流动因子（d）的变化Fig.1 The elastic index（a），solid liquid balance（b），macroscopic viscosity index（c），and fluidity index（d）of yogurt during the fermentation

发酵开始至3.8 h，发酵乳样品的SLB 处于波动状态，酪蛋白胶束的pH 值降低，净负电荷逐渐减少，胶束之间的静电斥力逐渐减小，从而对胶束的稳定性产生影响[22]。3.8 h 后SLB 值在拐点后开始缓慢上升，使原有的酪蛋白聚发生解离，样品逐渐达到微黏性状态。当SLB 为0.5 时为凝胶点，E组最先到达凝乳点，其它各组到达时间比较接近，A 组较快到达凝乳点。发酵终点时，SLB 值在0.7左右，样品具有更多的黏性液体特征，其中E 组发酵乳的SLB 最高，而D 组最低。

除E 组发酵乳外，其余发酵乳样品的EI 在3.8 h 内保持稳定，在此期间MVI、SLB 和FI 值处于较大的波动状态，原因是酪蛋白未形成凝胶的网状结构[22]。4 h 开始，A、B、C、D 组发酵乳EI 出现拐点且迅速呈垂直上升，到达凝胶点。随发酵时间的增加，发酵乳中的酪蛋白发生完全解离并快速聚集形成凝胶结构，EI 值达到最大[23]。到发酵终点时，A组与对照组E 组的EI 值接近，略大于其它各组，表示形成的凝胶结构更为紧密。

试验各组发酵乳在发酵前3.8 h，MVI 值在同一时期保持在一定水平范围内波动，这是处于低黏度的初始停滞阶段，原因是未形成凝胶网络结构[24]。3.8 h 后，A、B、C、D 组发酵乳样MVI 迅速上升，可能由于酪蛋白胶粒发生解离后开始形成凝胶，之后各发酵乳样品进入高黏度阶段使MVI 迅速增至最大值[25]。5.3 h 左右出现同样的趋势。发酵终点时形成网络结构，各组发酵乳最终形成稳定的凝胶结构。

发酵3.8 h，除发酵乳E 组外，其它各组FI 值均处于波动状态，表现为液态性质。4.5 h 后出现拐点，FI 值从直线下降到平缓下降，达到10-2Hz后基本保持不变，说明样品具有较高的黏性液体性质。到发酵终点，E 组发酵乳的FI 最低。

2.3 质构特性

贮藏过程过程中，5 组发酵乳的质构特性见表5。由于后酸和酪蛋白水合作用等因素会影响发酵乳的硬度、脱水收缩等质构特性，因此本试验中所有质构参数均在贮藏期测定。5 组发酵乳的硬度、内聚性、稠度、黏度指标均存在显著差异（P〈0.05）。其中硬度和黏度指数在贮藏1，7，21 d 有差异（P〈0.05），贮藏14 d 时无差异（P〉0.05）。稠度和内聚性在贮藏1，7，14，21 d 均有差异（P〈0.05）。有研究表明硬度直接影响酸奶质量[26]。本研究中，E 组具有最大硬度，其次是A 组，再次是C 组，说明A、C 组酸奶质量较好。从稠度、内聚性、黏度指数角度分析，A、C 组发酵乳的相关参数比其它发酵组高。从总体分析，A、C 组发酵乳与商业发酵剂组相似，表现出优良的性能。吴淼等[27]研究表明：发酵乳的蛋白水解活性、酸化能力、硬度和黏稠性均随贮藏时间的延长而增加（P〈0.05），而内聚性、持水力和感官评分显著下降（P〈0.05）。而在本研究中，与嗜热链球菌S10 复配的IMAU20450、IMAU62091 持水性并未下降，可能是由于嗜热链球菌S10 与保加利亚乳杆菌复配发酵可增加发酵乳的特性。

表5 发酵乳贮藏期间质构参数分析Table 5 Analysis of texture index of fermented milk

2.4 贮藏稳定性

本研究对各组发酵乳样品在贮藏期间的滴定酸度、持水性和黏度变化情况进行测定，综合评价在不同时间保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌复配发酵乳后酸及稳定性情况，结果如图2、表6 所示。

图2 发酵乳在25 ℃贮藏14 d 期间pH 值和滴定酸度（TA）变化Fig.2 Changes in pH and titratable acidity of fermented milk during storage at 25 ℃for 14 days

表6 发酵乳4 ℃贮藏21 d 的pH 值、酸度、持水性和黏度变化Table 6 Changes of titratable acidity，water holding capacity and viscosity of yogurt samples during storage

2.4.1 后酸化评价结果 后酸化指发酵乳在运输、销售过程中，乳酸菌仍生长繁殖，持续产酸使酸度继续升高的现象。后酸化不仅使产品品质下降，还会影响酸奶的货架期。采用25 ℃贮藏14 d的pH 值和TA 变化来评估各组发酵乳后酸化情况，结果如图2 所示。在发酵乳贮藏期间生长产酸的保加利亚乳杆菌是造成产品后酸化现象的主要原因[28]。本研究中，不同株保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌S10 复配时表现出的后酸化情况不同。第3 天时，各组发酵乳pH 值和TA 值变化虽较大，但无显著差异（P〉0.05）。第7 天时，发酵乳A、C 组的TA 值显著低于其它各组（P〈0.05），且差异持续至14 d 贮藏结束。说明菌株保加利亚乳杆菌IMAU20450、IMAU62091 与嗜热链球 菌S10 复 配时具有较好的弱后酸化能力。

2.4.2 酸度 酸度是衡量酸奶风味的一个重要的指标。贮藏1 d 至7 d 时，E 组的TA 值最大，从14 d 至21 d 时增加趋势变得缓慢，甚至出现下降的趋势。从贮藏期间滴定酸度看，贮藏1 d 时A、C、D组发酵乳无明显差别，7 d 时A、B、C 组发酵乳无明显差别，14 d 时A、B、C、D、E 组发酵乳无明显差别，21 d 时A、E 组发酵乳无明显差别。在4 ℃贮藏时1，7，21 d 酸度均有明显差异（P〈0.05），而14 d时酸度无差异（P〉0.05），这与持水性表现出一致性。

2.4.3 持水性 持水性用来衡量发酵乳的乳清存在于蛋白质结构中的稳定性。发酵乳贮藏1，7，21 d 时A、B、C、D、E 组发酵乳的持水性无差异（P〉0.05），14 d 时的持水性有明显差别。这与发酵过程中表现出的内聚性一致。5 组发酵乳的持水性都较好，在60%～80%范围。李慧等[29]对搅拌型酸奶的持水性及黏度的测定表明，黏度总体上与持水性呈较高的正相关，随黏度发生改变，与本研究相符。此外，4 株保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌S10 复配发酵后发酵乳的持水性均良好。

2.4.4 黏度 贮藏期间，各试验组发酵乳的黏度与对照组无显著差异（P〉0.05），说明4 株保加利亚乳杆菌和嗜热S10 复配后可以提高发酵乳的黏度，达到商业发酵剂的标准。石月锋等[30]在研究凝固型酸奶贮存过程中的特性时发现酸奶的黏度和酸度存在一定的相关性，随着黏度增加，酸度反而减小。在本研究中没有明显的差别，可能由于复配的发酵乳可以达到商业发酵剂黏度的水平。Xu等[31]研究了嗜热链球菌S-3 与德氏乳杆菌复配发酵在酸奶中的应用，并对其胞外多糖（EPS-S3）结构进行表征。通过流变学研究结果显示EPS 具有增加发酵乳表观黏度的作用，而蔡淼等[32]研究显示，EPS 虽可以增加发酸乳的表观黏度，但其添加量与酸乳质构没有明确的关系。

3 结论

将保加利亚乳杆菌IMAU20450、IMAU95110、IMAU62091、IMAU62161 与嗜热链球菌S10 进行复配，以商业发酵剂为对照，分析各组发酵乳发酵过程中凝胶特性和贮藏稳定性，并评价后酸化特性。结果表明，各株保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌S10 复配的发酵过程中形成凝胶的微流变特性类似，其中保加利亚乳杆菌IMAU20450 复配时形成的凝胶较为紧密。保加利亚乳杆菌IMAU20450、IMAU62091 与嗜热链球菌S10 复配发酵乳表现出弱后酸化特征，具有较好的贮藏稳定性，感官评分较高，说明这几株菌有深入研究的价值及较好的应用前景。本研究是基于我国自主知识产权乳酸菌菌株开发乳酸菌发酵剂，可为进一步研究提供物质基础和数据参考。