中药防治病理性瘢痕的信号通路研究现状*

赵 悦,赵文斌,郭 晴,郭媛媛,谢兵

(云南中医药大学第一附属医院/云南省中医医院,云南 昆明 650021)

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,是创伤后伤口异常愈合所引起的皮肤纤维化疾病,中医上又称为蟹足肿或巨痕症。临床表现为色红质硬的肿块隆出正常皮肤表面,范围局限或超过病灶,形状不一,可伴有瘙痒、疼痛等异常感觉,或者发生挛缩、造成畸形,给患者的身心造成极大负担。治疗方法包括手术、激光、放射、物理加压、注射激素等,虽然运用比较广泛,但仍存在费用昂贵、容易复发、不良反应及副作用较多等问题。中药治疗病理性瘢痕历史悠久,经验丰富,近年来实验研究发现其作用机制与成纤维细胞、炎症反应、细胞外基质(ECM)、胶原代谢、肉芽组织及血管生成等有关。本文对近年来中药通过调节信号通路影响病理性瘢痕形成的研究现状综述如下。

1 转化生长因子-β(TGF-β)/激活素受体样激酶(ALK)/Smads蛋白信号通路

转化生长因子β(TGF-β)能够诱导免疫细胞向伤口聚集,促进细胞外基质的产生,诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞以及增加血管生成等能力,在瘢痕疙瘩的形成中发挥重要作用[1]。TGF-β中的TGF-β1是与增生性瘢痕形成最密切的生物活性因子。Smads蛋白家族是调节细胞内TGF-β的特异性蛋白质,它可以对活化的TGF-β受体复合物作出应答[2],是TGF-β信号传导的关键介质[3]。Smad蛋白分为3类:Smad1、2、3、5被称为通路限制 Smad;Smad4称为普通Smad;Smad6、7是抑制Smad。ALK是TGF-β的Ⅰ型受体,与其配体结合传导信号。

TGF-β活化后与丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合,形成稳定的配体受体复合物,激活smads蛋白传递信号,作用于下游受体,从而调节靶基因转录,调控成纤维细胞增殖、分化及细胞外基质的合成。

1.1 体外实验(包括病理性瘢痕成纤维细胞、增生性瘢痕成纤维细胞、瘢痕疙瘩成纤维细胞等) 林尊文[4]推断粉防己碱抑制增生性瘢痕成纤维细胞的机制可能是通过诱导smad7表达和下调smad2,以阻断下游信号通路传导,从而抑制Ⅰ、Ⅲ胶原表达和细胞増殖。张浩等[5]发现莪术二酮通过下调TGF-β1/Smads信号传导通路,促进胶原酶解,从而有效改善增生性瘢痕的发生与发展。有研究[6-8]表明,黄芪甲苷、黄芪总苷能抑制瘢痕HSF细胞增殖,诱导细胞凋亡,负向调控TGF-β1/Smads信号传导通路。徐志山等[9-12]研究发现苦参碱、氧化苦参碱能影响自噬相关调控蛋白的表达,减少胶原合成,抑制TGF-β1/Smads信号传导通路。TANG M等[13]发现人参皂苷Rg3抑制细胞迁移,减少胶原合成及血管生成,同样可以达到下调TGF-β1/Smads信号传导通路的目的。而芍药苷可以诱导细胞自噬,抑制TGF-β1自分泌,减少α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,从而抑制TGF-β1/Smads信号传导通路[14-16]。SONG R等[17]探讨发现绵马素PB抑制细胞增殖和分化,减少胶原合成,下调 TGF-β1/Smads信号传导通路。许小琪等[18]通过丹参酮ⅡA在体外抑制HSF细胞增殖、分化,抑制Smad2、3磷酸化,下调p-Smad2/Smad2和p-Smad3/Smad3的比值,减少VEGF和COL I胶原的分泌,推断其可能与抑制TGF-β1/Smad信号通路有关。

唐黎黎[19]研究发现青蒿琥酯能够下调瘢痕上皮细胞TGF-β1和整合素β1的表达,并上调MMP-1的表达。李战等[20-21]研究证实青蒿琥酯下调HSF细胞中Smad3和I型胶原的表达,抑制结缔组织生长因子,促进MMP-1表达,减少胶原沉积。

He S等[22]发现黄芪和丹参的提取物可通过介导TGF-β/Smad途径,抑制胶原合成,减少瘢痕疙瘩的形成。复方芪参提取物的主要成分为黄芪总苷、黄芪多糖和丹酚酸,何淑芳[23]推论其可能是通过调控MAPK通路,间接影响TGF-β/Smad信号转导,经不同途径和多个靶点,共同发挥其抗瘢痕疙瘩作用。

青川复合物是由川芎素、青藤碱按2∶3比例配置的复合物。王畅研究发现青川复合物能够抑制TGF-β1、p-Smad2/3、p-Smad4蛋白的表达,同时上调p-Smad7蛋白从而达到阻碍TGF-β/Smad信号通路传导的目的,发挥抑制HSF细胞增殖和胶原蛋白合成以及诱导细胞调亡的作用[24]。

1.2 体内实验(包括兔耳增生性瘢痕模型、裸鼠瘢痕疙瘩模型等) Hou Q等[25]发现局部施用仙鹤草、藕节、乳香、蒲黄的提取物能够对TGF-β1/Smad通路产生双向调节作用,可以促进伤口愈合,并且减轻瘢痕形成。王爱丽等[26]探讨苦参素对裸鼠增生性瘢痕的抑制作用,发现苦参素涂膜剂能下调Smad3 mRNA和蛋白的表达,抑制TGF-β1/Smads信号通路,使瘢痕愈合率升高。王莎丽及周忠志等[27-28]的实验研究结果证明,积雪草苷可抑制皮肤瘢痕的形成,使瘢痕厚度、炎症反应、胶原沉积、成纤维细胞分化均减少,TGF-β1/Smads信号通路受到抑制。吕红梅[29]研究发现姜黄素抑制增生性瘢痕形成的机制可能是通过调控TGF-β1/Smad2/3 信号通路,使得瘢痕颜色变浅,质地变软。杨逸璇等[30]研究发现石榴皮多酚软膏能够降低TGF-β1、Smad4表达,调控TGF-β/Smad信号通路来抗增生性痤疮瘢痕。

2 TGF-β1/Smad泛素化调节因子2(Smurf2)信号通路

泛素-蛋白酶体途径是细胞中蛋白质选择性介导及降解关键组分的重要途径,其中的E3泛素连接酶可以泛素化降解细胞因子,从而在TGF-β1/Smad信号通路活性的调节中起到关键作用。据相关研究报道,E3泛素连接酶中的Smad泛素化调节因子2(Smurf2)能够参与影响多种纤维化疾病的发生发展。

体外实验研究中,王瑶等[31]发现补骨脂素可能通过TGF-β1/Smurf2信号通路,抑制α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白的表达,起到抑制瘢痕形成的作用。

在此基础上,刘昌玲[32]进一步研究推测,在增生性瘢痕成纤维细胞中,Smurf2 可能通过泛素化降解Smad7,减弱Smad7对TGF-β1信号转导的负向调控作用,从而增强TGF-β1/Smad信号转导,促进增生性瘢痕的形成。

3 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)由细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun 氨基末端激酶(JNK)以及p38组成。相关研究发现,大丝裂原活化蛋白激酶(BMK)/ERKS通路也与MAPK信号通路有关[33]。

3.1 细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路 ERK是具有丝氨酸和苏氨酸双重磷酸化能力且分布于细胞质内的蛋白激酶,主要包含ERK1和ERK2,在生长活跃的增殖期瘢痕中ERK1和ERK2基因表达明显偏高。ERK信号通路通过磷酸化的激活方式来调控细胞的生理功能。

体外实验[34-35]研究中,五倍子中的单宁酸能够调节miR-21/mTOR信号通路及miR-203的表达水平,抑制ERK1/2的磷酸化。张楠楠等[36]探讨丹参抗成纤维细胞增殖的作用后发现,隐丹参酮能够负向调控ERK/MAPK信号通路,下调MAP2K1及其下游MAPK1基因的表达,并促进caspase-3基因的表达,从而抑制HSF细胞增殖。Fan C等[37]发现紫草素通过ERK/Smad信号通路,减少TGF-β1诱导的胶原产生,下调瘢痕中的α-SMA表达,从而减弱细胞收缩。Tang M等[38]研究得到人参皂苷通过影响TGF-β/Smad和ERK信号通路,可以抑制增生性瘢痕的血管形成和细胞外基质沉积。朱君等[39]研究发现表儿茶素降低活性ERK1/2的蛋白表达,阻滞细胞周期,从而抑制成纤维细胞增殖。马新苹等[40]以不用浓度的白芍总苷处理瘢痕疙瘩成纤维细胞,结果发现其可以抑制纤维化标记蛋白Ⅰ型胶原α1链、Ⅲ型胶原α1链和α-SMA的表达,抑制ERK信号通路活化,诱导细胞凋亡。

3.2 P38/MAPK信号通路 P38/MAPK是合成胶原蛋白、刺激细胞外基质产生的正向调节剂,同时也是TGF-β1及α-SMA的传导介质。

陈剑钰等[41]通过体外实验研究发现齐墩果酸通过激活p38和JNK通路线粒体死亡途径,可以下调MMP-1、TIMP-1、P3I1、TGF-β1蛋白的表达,并上调MMP-2的表达,抑制瘢痕增生指数,增加胶原纤维的疏松度,从而诱导细胞调亡。

3.3 c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路 JNK信号通路同样通过磷酸化活化参与影响细胞的生理功能。

体外实验研究发现齐墩果酸能够激活JNK通路从而诱导细胞调亡[41]。有研究报道,艾叶中的异泽兰黄素能够抑制PDGFβ蛋白的表达,促进JNK磷酸化和Bcl2表达,从而抑制PDGFβ/ERK通路,上调JNK/Bcl-2信号传导通路,共同发挥诱导细胞凋亡的作用[42-43]。

复方芪参提取物对瘢痕疙瘩的作用机制,除了干扰TGF-β/Smad信号转导通路外,还能调控MAPK通路[23]。其中p38通路负责调控Smad2/3磷酸化、Smad2/3/4复合物以及Smad7表达;ERK和JNK通路则负责调控Smad2/3磷酸化的转位入核,以上均提示ERK、JNK和p38通路均参与调控靶基因PAI-1的转录活性及蛋白表达。

4 音猬因子(SHH)信号通路

Shh信号通路能够调控细胞周期、诱导细胞凋亡。Shh激活后与其膜蛋白受体(Ptch)结合,同时释放平滑蛋白(Smo)后激活核转录因子Gli,从而传导信号。有学者研究发现Shh信号通路可以上调促凋亡基因从而诱导成纤维细胞的凋亡。

4.1 体外实验 有研究表明,紫草素能够下调Shh信号通路的下游基因Ptch-1和Gli-1的表达,影响凋亡相关蛋白(Cyclin D1、Bcl-2)的表达,从而诱导细胞凋亡[44],减少胶原合成和血管生成[45-46],可以推断紫草素是通过阻断Shh信号通路来达到抵抗成纤维细胞活化的作用。

康复新液联合积雪苷霜软膏可以明显缓解增生性瘢痕的瘙痒、疼痛等症状,改善瘢痕的厚度、硬度、颜色等皮损形态,经实验证明其原理可能是通过抑制Shh、Patch、Smo、Gli-1等不同因子,下调SHH信号通路活性,从而抑制成纤维细胞的过度增生[47]。

4.2 体内实验 赵文斌等[48-49]研究发现傣药咪多领(又名云南琵琶甲)能逆转Hedgehog信号通路相关蛋白的表达,降低Nanog、Oct4以及SHH、Patch、Smo、Gli-1的表达水平。此外,研究还发现咪多领能上调miR-27b-3p,抑制GDF-6,从而抑制HSF细胞中GDF-6、COL1a2、COL3a1和α-SMA的表达水平。

5 磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路

PI3K是生长因子受体中的重要因子,参与介导例如细胞骨架重组、细胞存活、细胞凋亡等多种重要的生物事件[50]。AKT又称PKB或Rac,同样参与细胞存活和凋亡的过程。mTOR属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的关键蛋白分子,可以影响蛋白质翻译、基因转录以及成纤维细胞生长周期,激活下游底物,调控PI3K/Akt信号通路。除此之外,PTEN也具有拮抗信号通路活化的作用。总而言之,PI3K、Akt是信号通路传递的必要途径,mTOR分子是信号通路作用的下游靶蛋白,都能调控纤连蛋白的表达。

如果发生与损伤相关的炎症反应时,PI3K/Akt/mTOR通路的激活因子(包括表皮生长因子、促生长因子、胰岛素和钙调蛋白等)就会被释放出来,首先激活PI3K磷酸化,然后磷酸化质膜上的Akt立刻激活下游的mTOR和金属蛋白酶,从而控制成纤维细胞的生长以及纤维蛋白的表达[1]。

5.1 体外实验 鹿晓兰[51]研究发现中药单体虎杖中的白藜芦醇对瘢痕疙瘩TGF-β1/mTOR通路中TGF-β1、PI3K、mTOR等关键分子具有抑制作用;唐志铭等[52]观察到白藜芦醇能够下调成纤维细胞中mTOR信号通路的关键分子Akt、mTOR的表达,从而抑制PI3K/Akt/mTOR信号传导通路。相关研究[53-54]表明,莪术二酮除了与TGF-β1/Smads信号传导通路有关外,还能够下调PI3K/Akt/mTOR信号传导通路[5]。三七皂苷R1可以下调PI3K/Akt信号传导通路。WANG M等[55]研究发现红豆杉中的紫杉醇能抑制细胞侵袭,阻滞细胞周期,减少炎症反应,下调Akt信号传导通路。绵马素PB也可以下调PI3K/Akt信号传导通路[17]。单宁酸同样抑制Akt的磷酸化[34-35]。李娜[56]研究发现白僵蚕能够有效抑制包括PI3K/Akt在内的多种分子信号通路。吴登艳等[57]不同浓度的黄芩苷对瘢痕的抑制作用,发现其通过下调PI3K/Akt/mTOR信号通路来抑制增生性瘢痕。SILB等[58]研究发现槲皮素可以降低Akt的磷酸化,抑制PI3K/Akt通路,同时抑制HIF-1。

5.2 体内实验 据相关研究显示,由黑醋、五倍子、蜈蚣、丹参、威灵仙、地骨皮、白矾等中药成分组成的五倍子瘢痕膏,也能够抑制PI3K/Akt/mTOR 信号传导通路[34]。

6 Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路

Wnt信号通路已被证明在细胞增殖、分化、凋亡、成活、迁移等在内的各种功能中起着关键性作用。Wnt/β-catenin信号的相关分子(如Wnt3a、Wnt5a等)能够影响成纤维增殖、迁移和胶原生成的过程,参与瘢痕疙瘩的发病机制。在Wnt/β-catenin信号转导通路中,糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是Wnt的下游信号分子,是β-catenin的上游信号分子。Wnt/β-catenin信号转导通路主要受控于GSK-3β的磷酸化[59]。

6.1 体外实验 费猛[53]研究表明三七皂苷R1除了能下调PI3K/Akt信号传导通路外,还能抑制GSK-3β的磷酸化,下调Wnt/β-catenin信号传导通路。紫杉醇同样影响多个信号通路,不仅下调Akt信号传导通路,还下调GSK-3β信号传导通路[55]。

6.2 体内实验 秦慧真等[60]整理归纳了积雪草苷治疗多种疾病的复杂药理作用,其中有关积雪草苷抑制瘢痕增生、修复皮肤损伤的作用机理是能够抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原、抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的表达,负向调控Wnt/β-catenin信号通路的活性,同时上调TGF-β1、血管内皮生长因子、一氧化氮合酶、单核细胞趋化蛋白1的表达等。

7 其他

虽然以下信号通路的相关文献还有待完善,但作为影响病理性瘢痕的重要环节,其也有望成为中药防治病理性瘢痕的新方向、新靶点。

7.1 JAK/STAT信号通路 JAK/STAT通路中最重要的是STAT3分子[61]。细胞因子在组织损伤后大量释放,同时Janus激酶磷酸化STAT3,激活细胞因子转录应答基因[62]。STAT3在细胞增殖、迁移以及产生炎症反应等多种影响瘢痕的因素调控中起着主导作用[63]。

7.2 整合素信号通路 整合蛋白家族由主要细胞表面受体及整合素受体等组成,和ECM相互作用介导信号转导,参与调控生长因子、应答机械信号、调控细胞骨架重组等多种过程[64]。

7.3 TLR通路 Toll样受体(TLR)激活炎症反应,拮抗TGF-β阻滞剂发挥作用,在瘢痕疙瘩形成与发展过程中具有促进作用。其中TLR6、7、8在瘢痕疙瘩中表达明显上调。

7.4 上皮—间质转化通路 上皮—间质转化(EMT)是指细胞由上皮细胞转变为间充质细胞的变化过程[61]。EMT过程中涉及到TGF-β、Smad、HIF-α、TNF-α、IL-1α、IL-1β等目前对于瘢痕疙瘩机制研究中几乎所有的分子。因此,EMT及其通路的发现能大大拓宽瘢痕疙瘩机制研究的道路[65-66]。

8 小结

病理性瘢痕的发病机制和影响因素非常复杂,本文只针对近年来中药与病理性瘢痕形成的相关信号通路做了简要阐述,但仍存在一些不足。首先,上述几种信号通路之间的关系还未完全明确。其次,由于中药单体或复方制剂的有效成分在相关文献中没有具体数据统计,因此不能对每种成分进行比较分析。此外,文献的研究方法以体外瘢痕成纤维细胞实验为主,基于体内研究的动物模型相对较少。最后,作用机制大多探究通路相关的重要环节,例如调控基因表达、磷酸化蛋白、激活下游信号分子等。因此后续可着重于信号通路之间、中药有效成分比较、动物模型或其他研究水平和药理作用等方面进行深层次研究。

随着信号通路相关研究的不断深入,医学对病理性瘢痕的治疗靶点也愈发精确。相信未来可以为中药预防和治疗病理性瘢痕提供崭新的研究思路,以获得更加高效低毒的临床中药制剂。总而言之,祖国医学的宝贵财富还有待我们继续探索和挖掘。