基于OAV和PCA的茄芯烟叶中关键呈香物质

毛亚浩 丁静怡 余君 王志 陈雄 杨春雷 姚兰

[摘 要]为探究恩施茄芯烟叶中性香气成分，筛选关键呈香物质，以晾制结束后的恩施茄芯烟叶作为研究对象，分别做了两组处理：无菌水发酵处理、Bacillus megaterium m1加培养基混合发酵处理，利用GC-MS鉴定茄芯烟叶中的中性香气成分，通过气味活性值（OAV）与主成分分析（PCA）相结合筛选其关键致香成分。结果表明：从茄芯烟叶共鉴定出30种中性致香成分，包括酮类11种、醇类5种、酯类1种、杂环类2种、烯烃类1种、醛类8种、酚类2种，其中酮类种类较丰富，烯烃类含量较高。挥发性成分中有11种OAV大于1，最终确认苯甲醛、4-乙烯基愈创木酚、苯乙醛、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2为恩施茄芯烟叶中性香气成分的关键呈香物质。这为解析恩施茄芯烟叶的特征性香味风格与品质定向调控提供了理论基础。

[关键词]茄芯烟叶；中性香气；气味活性值；主成分分析

[中图分类号]TS453[文献标识码]A

雪茄烟是一种卷烟产品，具有独特的香气^[1]。按照其不同的用途，可以将卷制雪茄的烟叶分为茄衣、茄套、茄芯^[2]。其中茄芯是雪茄的核心部分，决定着雪茄的味道和吸食过程中的香气品质^[1]。

香气是评价烟叶内在质量的重要指标和核心内容之一，其在很大程度上决定着烟叶品质的优劣^[3]。烟叶香气是由多种挥发性致香成分的组成、含量及相互作用共同决定的^[3]。在烟草重要香气的鉴定中，气相色谱质谱联用（GC-MS）是烟草挥发性香气成分鉴定和定量中常用的应用技术，但它无法确定挥发性香气成分对样品的贡献度^[4]。气味活性值（OAV）表示分子的浓度与其气味阈值的比值，其值越大，表明该挥发性物质对香气贡献度越大，可以用来分析关键呈香物质^[5]。胡安福^[6]等利用OAV明确了卷烟主流烟气中各成分对奶香、焦甜豆香的贡献度。范武^[7]等利用OAV明确了异戊酸和乙酸对卷烟主流烟气酸香贡献最大。杨靖^[8]等发现β大马酮、二氢大马酮的OAV均较大，在彰显烤烟烟气清香香韵方面起主要作用。多元统计分析方法中的主成分分析（PCA）通过降维，将交叉、重复、相互作用的变量进行剔除，确定最关键的变量^[9]。潘玲^[10]等对湖北烤烟中性香气成分的主成分分析，发现巨豆三烯酮、大马酮等是烤烟香味品质的主要成分。薛超群^[11]等对不同产地的烤烟烟叶外观特征指标进行主成分分析，确定了叶面组织、柔韧性、色度、油分、厚度、底色等为烤烟烟叶外观特征评价的指标。

烟叶的挥发性香气成分是其风味的主要贡献者^[4]。而发酵是提高茄芯烟叶品质的重要环节，微生物在发酵过程中发挥着重要作用，经过发酵的烟叶刺激性会降低，香气也更加突出^[12]。然而，关于恩施雪茄茄芯烟叶中性香气成分的关键呈香物质未见报道，因此研究该烟叶中性香气成分对于解析其风味特征与品质的调控具有重要意义。为了确定恩施茄芯烟叶中关键呈香物质，作为评价烟叶发酵优劣的重要指标，本研究对晾制结束的恩施茄芯烟叶做了两组发酵处理：无菌水处理、Bacillus megaterium m1加培养基混合处理，通过GC-MS来定性、定量烟叶中的中性香气成分，OAV结合PCA的方法来确定烟叶中性香气中关键呈香物质，以期为工业生产中提高恩施茄芯烟叶品质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试烟叶来自湖北恩施州晾制结束的CX-014雪茄茄芯。

供试菌种来自本实验室保藏的一株巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium m1）。

LB（Luria-Bertani）培养基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.2～7.4（用pH计进行调节，PE-28，梅特勒-托利多仪器有限公司）。

胰蛋白胨（生化试剂BR）来自北京双旋微生物培养基制品厂，酵母粉（分析纯）来自苏州嘉叶生物科技有限公司，氯化钠（分析纯AR）来自国药试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雪茄烟的固态发酵 参照蕈明娟^[13]的方法并进行了一定的调整，将Bacillus megaterium m1菌接种于50 mL LB培养基中，在37℃、200 r/min条件下培养至对数生长期，取对数生长期的菌液在10000 r/min离心5 min后，用无菌水清洗两次，加入50 mL新鲜LB培养基进行重悬，得到重悬液，然后将供试茄芯烟叶进行切丝，宽度为2 mm左右，称取75 g的烟丝放入自封袋中，均匀的将重悬液喷洒在烟丝上，平衡水分至30%，放入恒温恒湿箱中进行发酵，控制发酵过程中的温度、湿度，发酵结束后75℃烘干过40 mm孔径筛。

1.2.2 变温发酵 参照乔保明^[14]的方法，将茄芯烟叶的变温发酵过程分为三个阶段：第一阶段，35℃～40℃，培养箱湿度80%～85%，发酵6 d；第二阶段，40℃～45℃，培养箱湿度80%～85%，发酵6 d；第三阶段，45℃～50℃，培养箱湿度85%～90%，发酵6 d，同时设置两组实验，实验1为只补无菌水的变温发酵；实验2为按烟丝重量加入10%的Bacillus megaterium m1加培养基的变温发酵。

1.2.3 蒸馏萃取（SDE）（GC/MS）测定烟草致香物质 参考文献[15]测定雪茄茄芯中致香物质。

1.2.4 挥发性香气成分定性 将通过GC-MS分析得到的各色谱峰的质谱图在安捷伦科技自主研发的质谱数据库NIST14.0进行相似度对比，将匹配度最高的作为鉴定标准，得到定性的揮发性香气成分。

1.2.5 挥发性香气成分定量 采用内标乙酸苯乙酯定量香气成分，每个挥发性成分的含量

W_i=（30×M_i）/S_i×2/10    （1）

式中：W_i代表每个挥发性香气物质的含量，μg/g；M_i代表每个挥发性成分的峰面积；S_i表示内标乙酸苯乙酯的峰面积。

1.2.6 气味活性值计算 OAV为致香成分在体系中的浓度与该物质察觉阈值的比值^[16]

H_i=W_i/O_i（2）

式中：H_i代表挥发性香气成分的气味活度值；W_i代表每个挥发性香气成分的含量，μg/g；O_i代表每个挥发性成分在水中的察觉阈值，μg/g。

1.3数据处理

所有实验均设置3个平行，采用Origin 2019作图，SPSS26.0进行相关性分析和主成分分析。

2 结果与分析

2.1 雪茄烟叶中性香气物质组分分析

茄芯烟叶中性香气成分GC-MS定性定量分析及香气类型描述见表1。在烟叶中检测到30种中性香气物质，包括酮类11种、醇类5种、酯类1种、杂环类2种、烯烃类1种、醛类8种、酚类2种。从香气物质种类上来看，3种处理中酮类物质种类均较丰富，其次是醛类、醇类、杂环类、酚类、烯烃类、酯类。这些香气成分都是雪茄茄芯烟叶中重要的中性香气物质，对烟叶香气风格凸显有重要作用^[15]。其中菌加培养基发酵后中性香气物质总量较高，可达到905.38 μg/g，与发酵前、无菌水发酵后相比存在显著差异，这可能是由于加入Bacillus megaterium m1和培养基能协同促进雪茄烟叶发酵，提高香气质量。

茄芯烟叶中性香气主要分为6类，种类占比见图1（其中组分百分比是由该组分的含量与香气物质总量的比值）。此6类共同构成了烟叶的香气特征。3组样品中均以烯烃类含量最高，占中性香气成分总量的66%～75%；其次为酮类，占中性香气成分总量的14%～15%；再次为醇类（6%～13%）、醛类（2%～4%）、酚类（0.1%～2%）和杂环类（1%～2%）。

2.2 雪茄茄芯烟叶中性香气物质的OAV分析

香气物质对雪茄茄芯烟叶的特征香气风格的贡献不仅与该物质在烟叶中的含量有关，其阈值也是重要的参考依据^[21]。致香成分所呈现的风味强度可以用OAV来体现，OAV值越大，表明致香成分对香气的贡献越大^[22]。利用OAV值可以从浓度和阈值两个层面揭示香气成分对体系的贡献度^[23]。一般认为OAV大于1的致香成分为呈香的关键物质^[24]。

通过对30种中性致香成分中已报道的阈值查询和计算，发现其中11种中性香气物质的OAV不小于1（表2）。OAV由高到低依次是巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2、苯乙醛、吲哚、4-乙烯基愈创木酚、BETA-环柠檬醛、香叶基丙酮、苯乙醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-乙酰基吡啶、苯甲醛。其中巨豆三烯酮、香叶基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮具有典型的清香、果香和烟草香^{[19， 22]}；4-乙烯基愈创木酚具有木香^[25]。BETA-环柠檬醛具有清香^[19]；吲哚具有花香^[18]；3-乙酰基吡啶具有坚果香^{[16， 18]}；苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛带有果香和清香^[3]。

刘哲^[26]用OAV研究了烟草中的关键香气成分，发现巨豆三烯酮、苯乙醛、吲哚为烟草中的重要香气成分。沈进^[27]在对陈化烟叶的致香物质研究中，用OAV确定了陈化烟叶中重要的香气成分。这些重要的中性香气成分来源于不同的香气物质前体^[3]。

雪茄烟叶中存在着大量的香气物质，不同物质之间存在着复杂的协同、加和、抑制等相互作用^[28]。两个处理发酵后和发酵前茄芯烟叶主要中性香气物质间的OAV相关性分析见表3，结果显示茄芯烟叶的主要中性香气物质间存在着密切的关联程度，如苯甲醛、苯乙醛、3-乙酰基吡啶均呈显著正相关，6-甲基-5-庚烯-2-酮与苯乙醇、吲哚、巨豆三烯酮1呈显著负相关，苯乙醇与巨豆三烯酮2呈显著负相关。

2.3 雪茄茄芯烟叶关键中性呈香物质分析

对烟叶中11种OAV＞1的中性香气成分进行主成分分析^[30]，KMO检验根据变量间简单相关系数和偏相关系数的关系来检验变量数据^[31]。由表4可得KMO值为0.590（＞0.5），Bartlett球度检验的相伴概率为0.000（<0.05），说明烟叶中OAV＞1的11种中性香气成分适合做主成分分析^[31]。各主成分的特征值、方差贡献率、和累计方差贡献率见表5，由表5可以看出，主成分分析提取了前兩个关键主成分，其中主成分1的累计贡献率达到57.667%，主成分2的累计贡献率为38.533%，2个主成分的累计贡献率为96.201%（>90%），表明2个主成分构成的信息能够反映原来变量的大部分信息。在图2中，大椭圆（R²=1.0）表示100%的解释方差，小椭圆（R²=0.5）表示50%的解释方差，如果有成分处于小椭圆之中，说明此成分不能被主成分解释^[28]。11种中性香气成分均在大椭圆的附近，说明能够被主成分解释，也表明这些中性香气成分对雪茄烟叶的香气均有贡献。各变量对主成分的影响可用载荷表示，载荷绝对值越大，其影响越大^[32]。在图3中，以各主成分载荷绝对值在0.95以上的香气成分作为雪茄烟叶中的关键呈香物质。根据两个主成分中载荷值的大小依次为：苯甲醛、4-乙烯基愈创木酚、苯乙醛、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2，其中苯甲醛、苯乙醛的香气类型主要为甜香、果香、花香等；4-乙烯基愈创木酚、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2的香气类型为木香、清香等。

3 结论

恩施雪茄茄芯中11种OAV>1的主要中性香气物质存在着复杂的相互作用。本文运用OAV结合PCA的方法，最终确定苯甲醛、4-乙烯基愈创木酚、苯乙醛、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2为恩施茄芯烟叶中性香气的关键呈香物质。烟叶发酵过程中关键呈香物质含量的变化对烟叶香气品质具有重要影响，可用来评价恩施茄芯烟叶发酵后的品质。

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Analysis of Key Aroma Compounds in Filler Leaves

based on OAV and PCA

MAO Yahao¹， DING Jingyi¹， YU Jun¹， WANG Zhi¹， CHEN Xiong²， YANG Chunlei²， YAO Lan¹

（1 Key Laboratory of Fermentation Engin.，Ministry of Education，

Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China;

2 Hubei Provincial Key Laboratory of Industrial Microbiology，

Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China;

3 Hubei Tobacco Research Institute， Wuhan 430030， China）

Abstract：In order to screen the key aroma substances of cigar filler leaves from Enshi， two groups of treatments on the cigar filler leaves after drying were performed： sterile water， or Bacillus megaterium m1 plus the medium was mixed evenly with cigar filler leaves and then fermented for 18 days. The neutral aroma components in cigar filler leaves were determined by GC-MS， and the key aroma components were screened by the combination of Odor Activity Value （OAV） and Principal Component Analysis （PCA）. The result showed that a total of 30 neutral aroma components were detected from cigar filler leaves， including 11 ketones， 5 alcohols， 1 ester， 2 heterocycles， 1 olefin， 8 aldehydes， and 2 phenols Ketones are more abundant than other types of components， and olefins are the highest in content. Among the volatile components， 11 kinds of OAVs are greater than 1. Finally， benzaldehyde， 4-vinylguaiacol， phenylacetaldehyde， megastigmatrienon1 and megastigmatrienon 2 were selected as the key aroma compounds of neutral aroma components in cigar filler leaves from Enshi. The results of this study provide a theoretical basis for analyzing the characteristic aroma style and quality-oriented regulation of Enshi cigar filler leaves.

Keywords：Cigar filler leaves; Neutral aroma; OAV; PCA

[责任编校：张 众]