不同工艺下姜茎提取物的抑菌效果分析

王 瑞,刘 涛,闫 明

信阳农林学院,河南 信阳 464000

0 引言

姜(ZingiberofficinaleRosc.),为姜科姜属的多年生草本植物,在我国有着悠久的食用及药用历史[1]。我国生姜产品主要为初级产品,深加工的精细产品较少,主要利用部分为根茎,茎叶一般丢弃或者焚烧。王红萍 等[2]采用不同方法对文山生姜叶的营养成分进行了研究,发现姜叶中含有多种营养物质。为开发和利用生姜副产品——姜茎,对不同工艺下姜茎提取物的抑菌效果进行了研究,以期为养殖业替抗减抗,提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

由河南省驻马店市新蔡县生姜种植地提供姜茎。

1.2 仪器与试剂

智能温控电热套(郑西仪器科技(上海)有限公司);旋转蒸发器RE5520/RE52-99(上海亚荣生化仪器厂);大制冷量循环冷却器DL10-10000G(郑州长城科工贸有限公司);生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);超净工作台(上海苏净实业有限公司);电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);振荡培养箱(上海知楚仪器有限公司)。

大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌菌种由信阳农林学院预防兽医实验室提供。

1.3 姜茎有效成分提取

参考生姜有效成分的提取工艺[3-5]。

水提法:称取已处理好的姜茎100 g,加入1 500 mL蒸馏水浸泡10 min,用电磁炉加热至微沸并保持30 min,重复3次,合并3次煎液并过滤。

醇提法:称取100 g姜茎放入圆底烧瓶中,加入适当50%乙醇溶液,组装回流提取装置,设置提取温度为65 ℃,提取3次,料液比依次为1：10、1：5、1：5(g/mL),每次提取时间为1.5 h。合并3次滤液,减压回收乙醇。

用pH值为10的溶液提取姜茎有效成分,称取100 g姜茎放入圆底烧瓶中,加入蒸馏水,用浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值为10,提取温度为65 ℃,分3次提取,提取的料液比依次为1：8、1：6、1：5(g/mL),提取时间依次为1、0.6、0.5 h,合并3次提取液并过滤。

1.4 抑菌效果测定

采用纸片扩散法(K-B法):将滤纸用打孔器制成圆形,放入高压灭菌锅中灭菌,烘干备用。将不同工艺下姜茎提取物原液均浓缩至50 mL,相当于1 mL浓缩液中含有2 g姜茎原料,每种工艺提取的姜茎浓缩液一部分灭菌处理,另一部分不做任何处理,将滤纸片放入浓缩液中浸泡2 h。在超净工作台内用移液枪吸取0.5麦氏浊度的待测菌液500 μL接种到固体培养基上用涂布棒涂抹均匀,贴上制备好的药敏片3片。水提法、醇提法、碱溶液提取法中的空白对照为无菌水浸泡的滤纸片。操作完成的平板放入37 ℃培养箱中培养,到细菌生长旺盛时取出平板用十字法测量抑菌圈直径(mm),记录抑菌圈的平均值。

1.5 最低抑菌浓度(MIC)测定

采用微量二倍稀释法:将不同工艺下姜茎提取物再浓缩至8 g/mL,保存备用。将一次性96孔板放入超净工作台内用紫外线照射30 min以上,每孔均加入营养肉汤100 μL,在第1孔加入姜茎提取物100 μL。用移液枪将提取物和营养肉汤混合均匀后吸取100 μL加入第2孔中再次吹打均匀,重复此操作到第10孔。将待测菌稀释至105CFU/mL,每孔加入稀释好的菌液100 μL,第11孔加入无菌水作为阴性对照,第12孔作为阳性对照。最终提取物的浓度依次为:4 000、2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5 mg/mL。

将96孔板密封好后放入37 ℃恒温培养箱中培养16 h,由于提取物颜色过深,前几孔无法观察到有无沉淀或澄清度变化,所以结合平板涂布法判定结果。培养结束后,将每孔液体全部吸出接种到营养琼脂培养基上,涂布均匀后放入37 ℃恒温培养箱中培养16 h,取出平板进行菌落计数。平板上无细菌生长对应的一孔即为最低抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 姜茎水提物的抑菌效果

记录细菌培养4 h时,未灭菌与灭菌的姜茎水提物对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径,数据用Excel统计分析,由表1可知,姜茎水提物是否灭菌处理的抑菌效果差异不明显,说明姜茎水提物具有耐高温的特性,化学性质稳定。

表1 姜茎水提物平均抑菌圈直径 单位:mm

由表2可知,姜茎水提物浓度大于等于4 000 mg/mL时,大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长完全受到抑制,低于此浓度抑制效果减弱有少量细菌生长;且随着浓度降低,菌落数增多,空白对照孔液体澄清,阳性对照孔液体浑浊。

2.2 姜茎醇提物的抑菌效果

记录细菌培养4h时,未灭菌与灭菌的姜茎醇提物对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径,数据用Excel统计分析制表。由表3可知,姜茎醇提物是否灭菌对其抑菌效果没有显著影响,表明姜茎醇提物耐高温。姜茎醇提物对沙门氏菌的抑制作用明显强于其他3种菌,抑菌圈可达19.12 mm。

表3 姜茎醇提物平均抑菌圈直径 单位:mm

由表4可知,当醇提物浓度大于等于4 000 mg/mL时,沙门氏菌与链球菌的生长状态被完全抑制,低于此浓度时有少量细菌生长,且随着浓度降低菌落数增加。

表4 姜茎醇提物最低抑菌浓度

2.3 姜茎pH值为10的碱溶液提取物抑菌效果

记录细菌培养4 h时,未灭菌与灭菌的姜茎pH值为10的碱溶液对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径,数据用Excel统计分析制表。由表5可知,碱溶液提取物是否灭菌对抑菌效果没有显著影响,说明提取物耐高温。

表5 姜茎pH10碱溶液提物平均抑菌圈直径 单位:mm

由表6可知,当姜茎碱提物浓度4 000 mg/mL时对链球菌生长没有抑制作用,而对其他3种菌的生长完全抑制,浓度为2 000 mg/mL时只有少数细菌生长,所以姜茎碱提物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为4 000 mg/mL。

表6 姜茎碱提物最低抑菌浓度

3 讨论

抗生素使用不当,会使细菌产生耐药性并加速传播,大大增加环境中致病菌抵御抗生素的可能性,导致动物抗药性增强,对疾病的抵抗力降低,使得疾病不仅多发而且难治。在我国,由于很长一段时间内养殖门槛低、饲养体量大、散户多、饲养管理不善、动物发病率较高、饲养者安全用药意识缺乏等多种原因,普遍存在抗生素过量使用甚至滥用等问题,导致细菌耐药性增强,动物源性食品抗生素残留等问题日益凸显,为养殖业的持续健康发展带来风险隐患[6]。2020年1月1日起我国饲料中将全面禁止添加抗生素,“减抗”成为畜牧业发展的大趋势。推进安全、高效、绿色、环保的新型饲料添加剂及饲料产品的研究与开发,加快抗菌药替代品的技术集成与推广应用,是畜牧业持续健康发展的技术保证。卢仲钺 等[7]的研究表明生姜中黄酮类物质、姜油、姜辣素的粗提取物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑菌效果。另外,郑悄然 等[8]、邓方年[9]和刘瑞 等[10]的研究都表明生姜乙醇提取液均有一定抑菌作用,表现出一定抑菌活性。但对于其附属产物姜茎提取物的抑菌作用研究较少。而本试验结果表明,生姜茎叶含有抗菌活性物质。生姜提取物中成分复杂,已分离鉴定出400多种化学成分,不同工艺下姜茎提取物成分构成不同,这可能是导致抑菌效果差异的原因。2021年全国生姜种植面积达553万亩(1亩≈666.67 m2),生姜产能达1 219万t,随之产生的大量姜茎具有潜在的开发利用价值。合理利用这类资源,不但可以开发新型非常规饲料资源,且为畜禽养殖行业面临的抗生素替代、健康养殖问题提供了解决思路。

4 结论

试验采用纸片扩散法初步探讨了不同工艺下姜茎提取物的抑菌效果,同时也对提取物是否耐高温、高压进行了评估。结果为培养4h时姜茎水提物对链球菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用要优于大肠杆菌和沙门氏菌;醇提物对沙门氏菌的抑制作用明显优于其他3种菌;pH值为10的碱溶液提取物对4种病原菌的抑制作用基本相同;不同工艺下姜茎提取物是否高压灭菌对其抑菌效果没有明显的影响,说明各提取物具有热稳定性。姜茎水提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的最低抑菌浓度均为4 000 mg/mL,在此浓度下对其他2种菌没有抑制作用;醇提物对沙门氏菌、链球菌最低抑菌浓度均为4 000 mg/mL,在此浓度下对其他2种菌没有抑制作用;pH值为10的碱溶液提取物对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为4 000 mg/mL,在此浓度下对链球菌没有抑制作用。从4 h时各提取物对试验菌的抑制作用来看,对大肠杆菌的抑制作用从大到小排序为碱提物、姜茎醇提物、水提物;对沙门氏菌的抑制作用从大到小排序为醇提物、碱提物、水提物;对链球菌的抑制作用从大到小排序为水提物、醇提物、碱提物;对金黄色葡萄球菌的抑制作用从大到小排序为醇提物、水提物、碱提物。从提取物对4种菌的最低抑菌浓度来看,碱提物抑菌效果最好,其次为水提物和醇提物。