猪源多杀性巴氏杆菌分离鉴定及药敏试验

其美拉姆,胡洹圆,曾南方,陈弟诗,李 晏,颜其贵

1.西藏自治区林芝市察隅县上察隅镇农牧综合服务中心,西藏 察隅 860614 2.四川农业大学动物医学院,四川 成都 611130 3.巨星农牧有限公司,四川 乐山 614899 4.四川省动物疫病预防控制中心,四川 成都 610041

0 引言

多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida,Pm)是两端钝圆的革兰阴性小杆菌或小球菌,为条件致病菌常存在于动物和人的呼吸道中,当宿主抵抗力下降时或受到其他影响便会引发感染,感染的宿主有广泛性,包括牲畜、家禽和野生动物等。动物巴氏杆菌病主要表现为出血性败血症和出血性炎症等[1],同时它也是人兽共患性传染病病原,严重时可引起人菌血症[2-3],对人体健康造成威胁。Pm可以感染各种年龄阶段的猪,主要引起猪萎缩性鼻炎和猪肺炎等病症,这2种疾病均可导致猪出现呼吸障碍,影响生长和生产性能,甚至造成猪只死亡,同时该病会反复出现,使养猪业经济遭受严重的创伤[4]。

Pm是一种具有多种血清型的细菌。这些血清型的区分是根据细菌体内不同抗原成分的差异得出的。其中,根据脂多糖抗原和菌体抗原的不同被分为16个血清型和12个血清型。根据荚膜抗原的不同,又可以将其分5个血清型包括A、B、D、E、F。这些不同荚膜血清型的Pm对于动物的感染性不同[5],其中荚膜血清型A、B、D 3种都能引起猪的疾病发生,但引发的疾病有所差异,如:A型主要引起猪肺炎,主要为呼吸系统疾病;B型主要引起猪出血性败血症,导致猪出现严重的血液感染;D型则主要引起猪萎缩性鼻炎,导致猪鼻腔组织出现萎缩和损伤。Pm的致病性与其多种毒力因子的存在和表达密切相关[6],毒力因子的编码基因在细菌体内起着重要的作用,决定了细菌的致病能力和侵袭性。其中,Pm的主要毒力基因包括黏附素相关的编码基因(ptfA、pfhA)、铁摄取蛋白有关的编码基因(tonB)、外膜蛋白有关的编码基因(plpB)、编码唾液酸酶相关的基因(nanB)以及超氧化物歧化酶相关的基因(sodA)[7-8],此外,研究还发现荚膜Kmt1基因在Pm血清型分型中起着重要的作用,同时它还是Pm中重要的毒力因子之一[9]。

本试验对四川某猪场的发病猪肺脏等器官进行细菌分离鉴定,并对分离株进行荚膜血清型、主要毒力基因鉴定、药敏试验以及动物回归试验,来说明该菌的致病性,以期为该病的预防和控制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料

四川地区某猪场发病猪的肺脏、气管、心脏等器官。

1.1.2 试验动物

3头28日龄断奶仔猪,临床健康、体质量相近,由巨星农牧有限公司提供。

1.1.3 主要试剂

胰蛋白胨大豆琼脂培养基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;革兰染色液、瑞士吉姆萨染色液、胎牛血清、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、琼脂糖均购自北京索莱宝科技有限公司;药敏纸片均购自杭州滨和生物试剂有限公司;细菌DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;DL2000 DNA Marker、2×Green Taq Mix均购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离及染色镜检

将采集的病死猪肺脏组织在含有5%胎牛血清、0.1%NAD胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSA)平板上划线接种,置于37 ℃恒温培养箱内培养。24 h后从疑似菌落中挑取单菌落并将其接种到新的TSA平板上培养纯化,观察记录菌落形态。接下来,在新平板中挑取单菌落进行革兰染色镜检观察菌体的形态学特征,这些信息为后续的鉴定和研究提供基础。

1.2.2 16S rRNA的扩增

将分离的菌纯培养物与ddH2O稀释后作为模板,进行16S rRNA菌落PCR扩增。引物序列信息见表1,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR扩增体系为20 μL,如表2所示;PCR反应程序:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;45 ℃ 15 s;72 ℃ 30 s,共34个循环;额外延伸72 ℃ 5 min。最后,用琼脂糖凝胶进行电泳检测。将含目的片段的产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,并把测序结果与Gen Bank数据库中参考菌株进行序列比对。

表1 16S rRNA 扩增引物

表2 PCR反应体系

1.2.3 细菌种属鉴定与荚膜分型

将分离得到的菌株加至含有5%牛血清与0.1%NAD的TSB液体培养基中扩大培养,参照细菌DNA提取试剂盒说明书,提取菌株DNA作为PCR扩增模板,参照文献[10]合成Kmt1特异性和荚膜血清型引物进行PCR扩增。引物的序列信息见表3。PCR扩增体系与程序同1.2.2节一致。

表3 种属鉴定与荚膜分型引物信息表

1.2.4 分离菌株主要毒力基因检测

针对6种Pm主要毒力基因:4型菌毛蛋白(ptfA)、血球凝集素(pfhA)、超氧化物歧化酶(sodA)、外膜蛋白(plpB)、铁调节相关蛋白(tonB)、神经氨酸酶(nanH)等合成相关引物对分离菌主要的6种毒力基因进行PCR检测[11],引物信息见表4。PCR扩增体系与程序同1.2.2节一致。

表4 毒力基因引物信息

1.2.5 药敏试验

采用K-B法对分离菌进行药敏试验。首先,挑取纯化培养后的单菌落接种于营养TSB培养基中培养,使菌液最终浓度为1×108CFU/mL左右;使用灭菌棉签沾取少量菌液涂布于营养TSA培养基上,并放置抗菌药物的药敏纸片至平板上。37 ℃恒温培养24 h后,观察抑菌圈是否出现并测量抑菌圈的直径大小,直径大小可以反映抗菌药物的抑菌效果,参考微生物药物敏感性试验执行标准(CLSI)2019版进行结果判定。

1.2.6 分离菌动物回归试验

用纯化后的分离菌株培养至对数生长期活细菌量约为1×109CFU/mL,将3头28日龄巴氏杆菌阴性猪分成3组,将分离株进行动物回归试验[12],一组748号为滴鼻+肌注各1 mL Pm培养物(总量2 mL/10 kg),一组795号仅为用滴鼻(2 mL/10 kg);并以PBS作为阴性对照,感染后每天观察并记录各组的临床症状。用无菌棉签采集每组猪的鼻拭子进行分离致病菌;若感染猪发病致死,剖检观察感染组各器官的病理变化以及与对照组各器官对比;同时,将肝脏触片进行瑞氏吉姆萨染色后,观察细菌形态。

2 结果

2.1 细菌分离及染色镜检

将无菌采集的病死猪肺脏内容物接种于营养TSA平板上,置37 ℃恒温培养箱内培养,可见呈圆形、微凸起、表面光滑、边缘规则、半透明的露滴状细小菌落如图1(a)所示。对分离菌进行革兰染色,镜检可见革兰阴性细小、两端钝圆的短杆菌,呈单个或双个存在如图1(b)所示,符合Pm的特征。

图1 细菌分离及染色镜检图(1 000×)

2.2 16S rRNA的扩增

对分离菌纯培养物作为DNA模板进行16S rRNA菌落PCR扩增,获得为1 420 bp左右的基因条带(图2)。将测序结果与Gen Bank数据库中参考菌株进行序列比对,结果表明分离菌与Pm参考菌株(OL958441.1)的序列同源性高达99.6%。

M—DL2000 DNA Maker;1—分离菌;2—阴性对照。

2.3 细菌种特异性鉴定与荚膜血清型鉴定

利用Kmt1(460 bp)对分离菌进行特异性鉴定;同时,利用capA(1 044 bp)、capB(760 bp)、capD(657 bp)、capE(511 bp)、capF(851 bp)5种荚膜血清型对分离菌进行血清型鉴定。在Kmt1基因鉴定中获得大小为460 bp左右的基因条带(图3),与预期大小相符合,符合Pm的鉴定特征。在荚膜血清型鉴定中,结果显示获得1 044 bp左右条带,符合荚膜A型Pm基因条带大小(图3),测序后经NCBI序列比对,鉴定结果为荚膜血清型A型Pm的基因序列。

M—DL2000 DNA Maker;1、2—分离菌种PCR鉴定; 3、4—分离菌荚膜血清型分型。

2.4 分离菌主要毒力基因检测

对分离菌进行6种主要毒力基因PCR检测结果显示,该分离菌携带有plpB(282 bp)、ptfA(488 bp)、pfhA(286 bp)、sodA(361 bp)、tonB(261 bp)、nanH(287 bp)6种毒力基因,阴性对照均成立(图4)。

M—DL2000Marker;1、2—plpB,阴性对照;3、4—ptfA, 阴性对照;5、6—pfhA,阴性对照;7、8—sodA,阴性对照; 9、10—tonB,阴性对照;11、12—nanH,阴性对照。

2.5 细菌药敏试验

采用药敏纸片扩散(K-B)法对该分离菌进行22种抗菌素药物敏感性检测,抗生素的纯化物进行药敏试验,药敏试验检测结果如表5,该分离菌对氨苄西林、羧苄西林、头孢唑啉、头孢哌酮、多西环素、复方新诺、庆大霉素、诺氟沙星、氟苯尼考、氧氟沙星10种抗菌药物敏感;对头孢曲松、磺胺异噁唑、丁胺卡那、环丙沙星、呋喃唑酮5种药物中度敏感;对青霉素、头孢氨苄、四环素、阿米卡星、多黏菌素B、红霉素、克林霉素7种抗菌药物耐。

表5 分离菌的药敏试验

2.6 分离菌动物回归试验

2.6.1 临床观察

攻毒后12 h,攻毒组748号运动稍有减少,嗜睡,但刺激反应、呼吸均正常,对照组与攻毒组795号一切正常;攻毒后24 h,攻毒组748号体温偏低,食欲减少,但呼吸正常,对照组与攻毒组795号一切正常;攻毒后48 h,攻毒组748号不活跃,能站立但出现斜倚,食欲明显减退,精神沉郁,耳后背部出现红斑点,频繁摇鼻,攻毒组795号不活跃,嗜睡,采食减少,对照组一切正常;攻毒后62 h,攻毒组748号蜷卧状态,食欲明显减退,精神沉郁,眼睑发肿,有血性眼分泌物,鼻腔有少量鼻液,攻毒组795号食欲减少,反应不敏,对照组一切正常;攻毒后82 h,攻毒组748号死亡,攻毒组795号食欲减少,反应不敏,对照组一切正常。

2.6.2 剖检观察

对死亡仔猪进行剖检,肺脏充血,出现肉质病变;气管内有少量黏液分泌物并出现血性泡沫。对照组组织器官无病理变化。同时,将试验猪肝组织触片进行瑞氏吉姆萨染色,在显微镜下可以观察到呈蓝色且两极浓染、两端钝圆的小杆菌存在(图5)。

箭头所指部分为两极浓染细菌所在位置。

3 讨论

研究表明Pm有5种荚膜血清型,由于荚膜血清型与致病性之间存在一定的相关性,且它的每种荚膜血清型之间交叉的免疫保护效果差[13],因此,了解不同血清型Pm的感染性和致病特点,对于预防和控制相关疾病具有重要意义。其中血清型A、B、D均可诱发猪的疾病,A型主要引起猪肺炎[14]。本试验从病死猪肺脏气管心脏等器官中分离培养获得一株细菌,经过细菌分离鉴定、染色镜检、血清型与主要毒力基因检测等一系列的试验确定为荚膜血清型A型的Pm,这与发病猪主要表现为肺炎的临床症状相符。由于长期的滥用和不合理使用抗生素,Pm对许多常用的抗菌药物已经产生了耐药性。为了更好地了解Pm的耐药性情况,对此次A型Pm分离株进行药敏检测,结果显示,在22种抗菌药物的药敏试验中有10种抗菌药物对Pm较为敏感,5种药物中度敏感,而有7种抗菌药物则显示出较为严重的耐药性。特别是对于大环内酯类和青霉素药物,Pm表现出了明显的耐药性,这意味着这些药物在治疗Pm感染时的疗效可能较差。此外,研究还发现Pm对同类药物的耐药性存在差异,推测可能是因为临床中经常使用的抗生素有所关系,长期使用某一种抗生素会导致细菌对该类药物产生逐渐增强的耐药性,从而使该类药物在治疗Pm感染时的疗效减弱。这提示在使用抗生素时应谨慎,以免加剧细菌的耐药情况,进而影响到感染的治疗效果。而且,在猪场的日常养殖生产中,要做到预防为主、养治结合。

细菌的毒力因包括细菌毒素、细菌附着因子、细菌内毒素等,可以影响细菌的致病性、存活力和繁殖力。细菌性病原是动物呼吸道感染和死亡的主要原因,这些细菌能够通过空气中的微小颗粒或直接接触传播到宿主的呼吸道,引发疾病症状,其中Pm是常见的呼吸道致病菌[15],在动物中引起呼吸道感染的发病率较高。Pm菌株具有一系列的毒力因子,这些因子可以使细菌更容易附着于宿主呼吸道上皮细胞,并进一步侵入宿主组织。此外,其还能产生细菌毒素,这些毒素可以损害宿主细胞、破坏免疫系统的功能,从而导致炎症反应和组织损伤。为了更好地了解Pm菌株的致病机制,研究人员可以通过实验室中的细菌培养和动物感染模型来评估其毒力和致病性。从毒力基因检测和动物回归试验得到的结果中,推测本次分离到的A型Pm具有较强的致病性。首先,对分离株进行毒力基因检测,发现该分离菌携带6种主要毒力基因(ptfA、pfhA、sodA、plpB、tonB、nanH)。然后,对28日龄仔猪进行动物回归试验,联合滴鼻、滴鼻加肌内注射途径攻毒,攻毒后出现了食欲减退甚至厌食、精神不振、腹式呼吸、耳后、背部出现红斑、消瘦,眼睑发肿等典型临床症状;对其进行病理解剖发现试验猪肺脏充血,出现肉质病变;气管内有少量血性黏液分泌物并呈泡沫状等病理变化,在对肝组织触片进行瑞氏吉姆萨染色后,在显微镜下观察到呈蓝色且两极浓染的细菌存在,成功建立了猪巴氏杆菌病发病模型,并探讨了其在本源动物中发生发展的规律,有助于更好的应对和预防相关感染疾病的发生。

4 结论

本次试验成功分离得到一株荚膜血清型A型的猪源Pm,毒力基因检测结果与动物回归试验结果均显示该分离菌具有较强的致病性,为研究Pm的致病性提供一定参考,也对四川地区猪场防控具有警示意义。同时,该分离菌在22种抗菌药物的药敏试验结果仅有10种药物对该分离菌有敏感性,为临床上治疗该病提供有效、快捷的方法。