1株腹泻型大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

慈 丽,史纪强,李 晏,曾南方,颜其贵

1.甘肃省甘南州迭部县动物疫病预防控制中心,甘肃 迭部 747400 2.四川农业大学动物医学院,四川 成都 611130 3.巨星农牧有限公司,四川 乐山 614899

0 引言

大肠埃希菌(Escherichiacoli,E.coli)俗称大肠杆菌,是动物肠道中的正常寄居菌,在特定条件下,大肠杆菌可引起人和动物的肠道和肠外组织感染[1]。少部分血清型的大肠杆菌及其产生的毒素可引起猪发病,即猪大肠杆菌病[2]。该病主要引起猪肠道膨胀,肠系膜淋巴结充血肿大,肝、肾等组织脏器出现凝固性坏死[3],对仔猪生长发育影响重大,是影响养猪业发展的重要疫病之一[4]。不同日龄猪对大肠杆菌易感性不同,但仔猪对其易感性最高,因日龄的不同,仔猪的发病临床表现也不同,可分为以排黄色浆状稀粪为主的仔猪黄痢、排乳白或灰白浆糊状粪便的仔猪白痢和以胃壁等部位水肿为主的仔猪水肿病。目前,大肠杆菌病在世界各地均有报道,其发病率和死亡率在仔猪疾病中位于前列[5]。该病有较高的致病率和病死率,在我国多个地区时有发生,对我国的养猪业有严重的危害,可造成严重经济损失。

近来,四川某地猪场发生一起以腹泻为主要特征的疫情,发病快且具有较高的死亡率,为弄清楚其病原,特进行微生物学诊断和药敏试验,以判明其病因并提供治疗药物参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1)病料来源:四川雅安某猪场腹泻死亡仔猪。

2)试验动物:2头断奶仔猪,临床健康、体质量相近,由巨星农牧股份有限公司提供。

3)主要试剂:细菌DNA提取试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司;2×Rapid Taq Master Mix,购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;20×磷酸盐缓冲液(PBS),购自上海生工生物科技有限公司;药敏纸片阿莫西林、氨苄西林、氨曲南、丁胺卡那、多西环素、多粘菌素、恩诺沙星、呋喃妥因、氟苯尼考、磺胺异噁唑、美罗培南、庆大霉素、四环素、替卡西林、头孢噻吩、头孢噻肟、万古霉素、氧氟沙星等18种药敏纸片,均购自杭州微生物生物试剂公司;TSB培养基及麦康凯培养基,购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离及染色镜检

用无菌棉签采集死亡仔猪肠道内容物及粪便,置于EP管中,加入无菌PBS 1 mL,接种于麦康凯平板上,培养18～20 h,挑取圆形、光滑、湿润、边缘整齐、中等大小的粉红色小单个菌落革兰染色观察。并接种至TSB液体培养基扩大,37 ℃ 180 r/min振荡培养5～6 h后冷藏保存。菌液加入50%甘油生理盐水,置于-80 ℃保存。

1.2.2 16S rDNA 鉴定

使用细菌DNA基因组提取试剂盒提取冷藏保存的菌液的基因组DNA,以基因组DNA为模板,并以实验室已有的大肠杆菌作为阳性对照,采用表1中16S rDNA扩增引物,用2×Rapid Taq Master Mix经35个循环扩增后,在1.5%琼脂糖凝胶中电泳后观察结果,PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司,使用扩增引物进行测序。

表1 16S rDNA 扩增引物

1.2.3 大肠杆菌毒力基因的检测

根据参考文献[6]推荐的方法,合成对应引物,引物序列、目的片段大小见表2。以1.2.2节提取的基因组DNA为模板,使用2×Rapid Taq Master Mix 经35个循环扩增后,在1.5%琼脂糖凝胶中电泳后观察结果。

表2 ETEC/EPEC的毒力基因扩增引物

1.2.4 药敏试验

用纸片法(K-B)对分离菌进行药物敏感性试验,用游标卡尺测量各药敏纸片的抑菌圈直径,参照美国临床与实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)文件(M100-S21)判定结果。

1.2.5 动物回归试验

1.2.5.1 攻毒菌株制备

经过至少两代复苏培养、活力恢复的目标菌株接种到TSB肉汤中,37 ℃、220 r/min培养5～6 h至对数生长期,使用比浊管测试并调节菌液浓度到109CFU/mL,作为攻毒菌液。攻毒菌液现配现用。

1.2.5.2 动物试验分组

将2头仔猪分成2组,攻毒组1头,编号为739口服灌喂10 mL 2%碳酸氢钠溶液,0.5 h后灌服接种攻毒菌液10 mL 109CFU/mL并肌内注射1 mL 109CFU/mL。对照组,编号为751,口服灌喂10 mL 2%碳酸氢钠溶液,0.5 h后灌服10 mL PBS溶液并肌内注射1 mL PBS。

1.2.5.3 临床观察

攻毒后连续观察3～5 d,观察仔猪的排便情况、饮食情况及精神状态并记录仔猪发病时间和死亡情况。

1.2.5.4 剖检观察

对死亡仔猪进行剖检,并记录剖解症状,剖检后对各组织脏器以及肠道内容物进行细菌分离鉴定。

2 结果

2.1 细菌分离及染色镜检

病死仔猪肠内容物接种于麦康凯培养基上,培养18～20 h,可见光滑、湿润、粉红色小菌落,直径2～3 mm(图1a)。挑取单菌落,进行革兰染色,镜检可见形态均一,两端钝圆、革兰氏阴性、中等大小的杆状细菌(图1b),初步鉴定为肠杆菌科的细菌。

(a)麦康凯平板划线 (b)革兰染色镜检

2.2 16S rDNA鉴定

对细菌DNA进行16S rDNA扩增,PCR产物经1.5%凝胶琼脂电泳,该菌株在1 500 bp左右处有清晰条带,与预期条带大小相符(图2)。测序结果用GenBank Blastn软件进行相似性比较,结果发现分离株16S rDNA与GenBank中公布的大肠杆菌(MN208184)的16S rDNA序列同源性达到99%以上,确定分离的细菌为大肠杆菌。

M—DL 2000Marker;1—Y1;2—阳性对照;3—阴性对照。

2.3 大肠杆菌毒力基因的检测

结果显示,在5种常见致病性大肠杆菌相关毒力基因中,共检测出 STa、STb、LT、F4 K88ab这4个毒力基因(图3),证明该分离株为致病性大肠杆菌。

M—DL 2000Marker;1、3、5、7、9—分离株; 2、4、6、8、10—阴性对照。

2.4 药敏试验

采用药敏纸片法对分离到的大肠杆菌进行18种常用抗菌药物的药敏性检测,结果该细菌对7种药物耐药,对2种药物中介,对9种药物敏感,具体检测结果如表3所示。

表3 药敏试验结果

2.5 动物回归试验

2.5.1 临床观察

攻毒后12 h,攻毒组仔猪运动稍有减少,嗜睡,但刺激反应正常,被毛粗糙,采食正常,粪便稀软但成形,肛周及会阴部未见粪污;对照组仔猪一切正常。攻毒后36 h,攻毒组仔猪运动稍有减少,嗜睡,刺激反应减弱,被毛粗糙,采食减少,出现拉稀症状,粪便糊状不成形,无粪水分离现象,肛周粪污明显;对照组仔猪一切正常。攻毒后48 h,攻毒组仔猪不活跃,能站立但出现斜倚,瘦弱,食欲明显减退,出现血便情况,肛周粪污明显(图4);对照组仔猪一切正常。攻毒后62 h,攻毒组仔猪死亡;对照组仔猪一切正常。

图4 肛周粪污明显

2.5.2 剖检观察

对死亡仔猪进行剖检,腹腔内有大量腹腔积液;小肠扩张、肠壁变薄、严重水肿出血(图5a),肠系膜淋巴结肿大、充血(图5b)。

图5 感染仔猪的病理解剖病变

2.5.3 组织细菌分离

分离死亡仔猪病变脾脏及肠内容物中的病原菌,染色镜检结果与原分离菌形态一致。

3 讨论

在饲养环境变化、感染了其他免疫抑制性疾病或腹泻性疾病后,仔猪易发生大肠杆菌病。本试验在猪场前期对常见病毒性腹泻病原筛查均为阴性的基础上,根据发病死亡仔猪的临床症状,怀疑该猪场猪感染了大肠杆菌。引起腹泻的大肠杆菌主要类型是产肠毒素型大肠杆菌(Enterotoxigenic E.coli,ETEC)和肠致病型大肠杆菌(Enteropathogenic E.coli,EPEC),ETEC会引起新生仔猪腹泻和断奶仔猪腹泻,EPEC会引起断奶仔猪腹泻[7]。引起断奶仔猪腹泻的ETEC会携带菌毛F4(k88)或者F18并产生黏附素从而更好地定植于肠道,定植后会在肠道产生一种或多种肠毒素,例如热稳定型毒素a(heat stable toxin a,STa)、热稳定型毒素b(heat stable toxin b,STb)和热不稳定型毒素(heat labile toxin,LT)[8]。本试验通过毒力基因的筛查,确定所感染大肠杆菌含有的毒力基因为STa、STb、LT、F4 K88ab,该4种毒力基因均是ETEC常携带的毒力基因,分离株携带全部4种腹泻毒力基因,证明其毒力强,这可能是该猪场出现数十头仔猪腹泻死亡的原因。因此对分离株进行动物回归试验,确定其对仔猪能致腹泻死亡,判定该猪场仔猪腹泻死亡的病因为感染含有多腹泻毒力基因的ETEC。药敏试验结果表明,从该猪场分离出来的菌株对阿莫西林、氨苄西林、多西环素、呋喃妥因、磺胺异噁唑、四环素、万古霉素等表现出不同程度耐药,可能是由于该猪场使用抗生素不规范、不科学、未轮换用药,或该猪场所感染的大肠杆菌菌种本身就是耐药菌。而耐药性细菌感染数量的上升已经严重威胁公众的身体健康,感染的发病率和致死率均很高[9]。

4 结论

本试验从四川雅安某猪场腹泻仔猪肠内容物分离获得了1株产肠毒素型大肠杆菌,确定了其能致仔猪腹泻死亡,并通过药敏试验确定其对氨曲南、丁胺卡那、多粘菌素、恩诺沙星、氟苯尼考、美罗培南、替卡西林、头孢噻吩、氧氟沙星9中药物敏感。本试验诊断出了该猪场腹泻的病因,并为后续该猪场仔猪腹泻病用药防控提供了参考。