磁微粒化学发光法检测抗RA-33、抗CCP 抗体及类风湿因子的临床应用评估①

荀春华 江代红 瞿 俊（重庆市巴南区人民医院检验科，重庆 400055）

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的慢性炎症性自身免疫性疾病，其主要病理改变为关节滑膜明显增厚并有大量炎症细胞浸润、血管翳形成以及由此造成的多个关节软骨和骨质的破坏，最终导致不可逆转的关节畸形，早期诊断是获得最佳治疗效果的关键因素［1-2］。生物标志物的发现对RA 的早期诊断和筛查具有重要作用。目前临床上使用的实验室指标主要为类风湿因子（rheumatoid factor，RF）和抗环瓜氨酸肽抗体（anticyclic citrullinated protein/peptide antibodies，anti-CCP），两者作为实验室诊断指标被纳入美国风湿病协会/欧洲风湿病联盟（ACR/EULAR）RA 分类标准［3-4］。近年来发现RF 亚型的检测对RA 的诊断和鉴别具有一定应用价值［5］。抗RA33（anti-RA33）抗体是1996年以来被认为对RA诊断特异度高的自身抗体，但近几年才应用于临床［6］。临床上检测这些自身抗体主要采用ELISA 法，也有用化学发光法和免疫比浊法［7-9］。而基于磁微粒吖啶酯化学发光法是近十余年来新兴的检测方法，具有灵敏度高、重复性好、快速、准确、自动化程度高等优点［10-13］。重庆市巴南区人民医院引进了国产化学发光仪，采用配套试剂可同时对anti-RA33、anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 五项指标进行检测，本文拟采用回顾性分析lis 系统中的检测数据，结合临床诊断，以此评估磁微粒化学发光法检测RA 相关自身抗体的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 资料 纳入标准：1 个月以上未使用免疫抑制剂治疗，临床诊断为RA（均符合2010年欧洲风湿病协会修订标准）［3］。共纳入105 例 RA 患者［平均年龄（57±12）岁，女79 例，男26 例］及年龄和性别匹配的疾病对照组71 例［平均年龄（56±13）岁，女55，男16 例］，其中骨关节炎34 例、临床表现为关节痛20例、结缔组织病17例。本研究获得重庆市巴南区人民医院伦理委员会批准［（2020）伦审（002）号］。

1.2 方法 anti-RA33、anti-CCP、RF、RF-IgG、RFIgM 均采用商品化的亚辉龙化学发光仪（型号：iFlash3000）及配套试剂（批号20211101）检测，检测原理均为吖啶酯标记的磁微粒化学发光法，最终检测产物为抗原-抗体-吖啶酯标记的二抗复合物，所有操作均按照说明书进行，分别以anti-RA33<16 AU/ml、anti-CCP<5.0 U/ml、RF<16 AU/ml、RF-IgG<16 AU/ml、RF-IgM<15 U/ml判断为阴性。

计算各指标的灵敏度（sensitivity，Se）、特异度（specificity，Sp）、约登指数（Youden index，YDI）、阳性预测值（positive predict value，PPV）、阴性预测值（negative predict value，NPV）、阳性似然比（+LR）和阴性似然比（-LR），评价各指标对RA的诊断价值。

1.3 统计学分析 所有数据分析采用SPSS22.0统计学软件进行，各指标均不服从正态分布，偏态分布的资料采用中位数（四分位数间距）［M（QR）］表示，两组比较采用Mann-WhitneyU检验，采用Spearman 相关分析检测变量间的相关性，受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析各检测指标对RA 的诊断价值，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组各指标检测水平比较 RA 组血清anti-CCP、RF、RF-IgG、RF-IgM 水平均显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），而anti-RA33 在两组间差异无统计学意义（P>0.05，表1）。

表1 非参数Mann-Whitney U检验分析两组各指标血清水平差异［median（QR）］Tab.1 Nonparametric Mann-Whitney U test was used to analyze difference in serum levels between two groups ［median（QR）］

2.2 各指标的临床评价 各自身抗体中，对RA 诊断的约登指数、阴性预测值、阳性预测值最高的是anti-CCP，anti-RA33 对RA 诊断的灵敏度最低但特异度最高，RF-IgG 对RA 诊断的灵敏度最高，约登指数第2，但特异度最低（表2）。

表2 5种自身抗体对RA诊断指标的评价Tab.2 Evaluation on five kinds of autoantibodies as diagnostic indexes of RA

2.3 ROC 曲线分析 ROC 曲线分析结果显示anti-RA33、anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 曲线下面积分（AUC）别为0.520、0.870、0.816、0.848、0.853，95%置信区间分别为0.434～0.607、0.815～0.925、0.752～0.879、0.790～0.906、0.796～0.911，除 了RA33P=0.649 外，其余P均=0.000，提示抗CCP 抗体、RF、RF-IgM、RF-IgG 对RA 诊断具有重要价值（图1）。

图1 ROC曲线分析Fig.1 ROC curve analysis

2.4 相关性分析 RA 组中，Spearman 相关分析显示（表3），anti-RA33 与anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG无显著相关性（P>0.05）。Anti-CCP 与RF、RF-IgM、RF-IgG呈现显著的相关性（P<0.05），RF与RF-IgM、RF-IgG 高度相关（P<0.05），RF-IgM 与RF-IgG 相关性显著（P<0.05）。由此可见，anti-RA33 与其余4 项指标（Anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG）无显著相关性，而这4项指标在RA中的血清水平高度相关。

表3 Spearman检验分析RA组各指标相关性Tab.3 Correlation analysis of each index in RA group by Spearman test

3 讨论

HASSFELD 等［14-15］采用免疫印迹法首次报道在RA患者中检测出抗RA-33（anti-RA33）抗体，该抗体与分子量33 kD 的核酸蛋白发生反应，因此被命名为anti-RA33 抗体，且在RA 早期诊断指标中，抗RA33 特异度最高，阳性率不高，大多在40%以下。Anti-CCP 抗体是临床上应用最多的诊断RA 的自身抗体，该抗体具有较高的灵敏度和特异度［2-4］；RF 是由于感染因子引起体内产生的以变性IgG 为抗原的特异抗体，主要存在于RA 患者血清中，IgM-RF、IgG-RF、IgA-RF 的定量检测对于提高RA 早期确诊率、降低漏诊率、评估疾病活动度均有重要意义［16］。

早期自身抗体的检测大多采用免疫印迹法和酶联免疫吸附试验，近十年来，随着化学发光法在临床的普及，越来越多的项目采用化学发光检测方法，基于磁微粒吖啶酯化学发光仪已经遍布中国大大小小的医院，本实验采用的方法原理为直接化学发光技术的两步间接免疫测试法。

通过检测受试者血清 anti-CCP、anti-RA33、RF、RF-IgG、RF-IgM，除anti-RA33 外，所测指标在RA 组均明显高于疾病对照组；本研究中anti-CCP 的灵敏度和特异度分别为70.48%和95.77%，与其他研究结果相符［2，7，9］。本研究所测指标中anti-CCP 对RA的约登指数、阳性预测值、阴性预测值以及AUC 均大于其他指标，说明 anti-CCP 在RA 诊断中确有较高价值。

采用ELISA 检测沙特阿拉伯人血清anti-RA33抗体，诊断RA 的灵敏度为7.32%、特异度为95.12%，anti-RA33 自身抗体似乎不是确诊RA 患者的重要免疫诊断标志物，在其他系统性结缔组织疾病中存在一定的阳性率［17-18］。进一步研究显示anti-RA33 抗体在165 例俄罗斯RA 患者中检测出24 例（14.5%）、58 例SPA 患者中检测出6 例（10.3%）、65 例SSc 患者中检测出11 例（16.9%）、50 例SLE 患者中检测出4例（8.0%），提示其并非RA患者特有的标志物，因此，对于其是否为RA 诊断的特异性标志物尚存在一定的争议［19］。本研究也证明anti-RA33出现的阳性率仅为8.57%，且在RA 组anti-RA33 血清水平并不高于疾病对照组，相关分析显示anti-RA33 血清水平与anti-CCP、RF、RF-IgG、RF-IgM 均无显著相关性，anti-CCP、RF、RF-IgG、RF-IgM 检测水平相互高度相关；ROC 曲线分析显示anti-RA33的AUC 仅为0.52，anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 的AUC 均大于0.8，提示anti-RA33 对RA 的诊断价值不大，anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG 对RA 诊断具有重要价值。

综上所述，ani-RA33 诊断RA 灵敏度过低，作为初筛实验容易漏诊；anti-CCP、RF、RF-IgM、RF-IgG对RA 具有重要诊断价值，可用于RA 疾病初筛检测。Anti-CCP 仍然是5 种自身抗体诊断准确性最高的自身抗体，可用于RA 的初筛和确诊。本研究采用的方法是基于吖啶酯磁微粒化学发光法，所检测RA 相关抗体符合临床诊断和相关文献报道，值得推广和应用。