IL-33及其受体ST2L在银屑病患者外周血T细胞及皮损组织中的表达①

张丽丽 刘霄霄 孙瑞雪 王 菲 杜红阳（锦州医科大学附属第一医院皮肤科，锦州 121012）

银屑病是一种由遗传与环境共同作用诱发的免疫介导的慢性、复发性、炎症性、系统性疾病。对患者的皮肤、心理健康甚至全身器官均可造成损害。目前其确切病因尚不清楚，但Th17 细胞及IL-23/IL-17轴在银屑病发病机制中可能处于关键地位，并且针对IL-17A、IL-23、TNF-α 治疗靶点的生物制剂已在临床治疗中广泛应用。IL-33 是IL-1 细胞因子超家族成员，组成性地表达于多种人类组织细胞上，在皮肤组织细胞上呈现一定表达。其受体ST2 基因在结构上与其他IL-1 受体（IL-1R）相似，而ST2L是IL-33的跨模型受体。IL-33与ST2L结合，并与IL-1 受体辅助蛋白（IL-1RAcP）形成复合物结合后发挥重要的生物学功能。但目前IL-33 及其受体ST2L 在银屑病患者和正常人表皮角质形成细胞、外周血T 细胞中的表达水平尚不清楚。因此，本研究分析了寻常型银屑病和脓疱型银屑病患者血清和皮损组织中IL-33 及其受体ST2L 的表达水平，旨在说明这些分子可能与银屑病的发生发展有关，为未来寻找银屑病的潜在治疗靶点提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 选择2022 年1 月至2022 年8 月在锦州医科大学附属第一医院初次就诊的寻常型银屑病（PV组）患者20例和脓疱型银屑病（PP组）患者20 例，同时收集20 例行体表色素痣切除者作为对照组（CON 组）。各组在年龄、性别上差异均无统计学意义（P>0.05）。PV 组和PP 组纳入标准：①符合《银屑病诊疗指南》寻常型银屑病和脓疱型银屑病的诊断标准，部分临床表现不典型者行病理检查，根据银屑病典型组织病理改变进行确诊；②近3 个月来未经任何系统和局部治疗；③排除其他皮肤疾病、合并其他自身免疫性疾病或其他系统性疾病等。CON 组纳入标准：无全身各系统疾病。本研究经锦州医科大学附属第一医院伦理委员会同意，患者签署知情告知书，伦理审批号：2022015。

1.1.2 主要试剂 人Jurkat T 细胞株（中国科学院上海细胞生物所）；HaCat 角质形成细胞（空军总医院中心实验室）；兔抗人ST2L 抗体（Bioreagents公司）。

1.2 方法

1.2.1 皮损组织提取及处理 在银屑病患者皮损区常规消毒后，用手术刀切取梭形皮肤组织，大小约1.5 cm×0.5 cm，取材深度0.2 cm～0.4 cm，缝合切口，对照组非皮损区按照同样方法进行取材。将获取的组织标本进行石蜡包埋制作石蜡切片。采用免疫组织化学Envision 2步法，操作方法按说明书进行。IL-33 和ST2L 抗体稀释倍数均为1∶100，一抗4 ℃过夜。二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，中性树胶封片。

1.2.2 Jurkat T 细胞和HaCat 角质形成细胞培养

Jurkat T 细胞置于T 细胞的培养液（RPMI 1640，15% 小牛血清、2%Na2CO3、1%HEPES、青霉素100 U/ml、庆大霉素100 U/ml），5%CO2、37 ℃、30%湿度条件下培养。HaCat 角质形成细胞在含10%胎牛血清及1%青链霉素的改良DMEM 培养基中，37 ℃、5%CO2条件下培养，待细胞单层铺满培养瓶后，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗1 次，加0.25%胰蛋白酶消化液，待镜下细胞圆缩时，DMEM 培养液终止消化，细胞收集于离心管中，600 g 离心5 min，弃上清，将细胞悬液分别移至冷冻管中，每管1.5 ml，将冻存管先置于4 ℃冰箱2 h，再移至-80 ℃低温冰箱24 h，置于-196 ℃液氮中保存备用。

1.2.3 外周血T 细胞的分离 圆底试管中放入淋巴细胞分离液2 ml。在另一试管中加静脉抗凝血（每毫升血液加20 单位肝素）2 ml，再加入同等量的Hanks 液使血液稀释。用毛细吸管将抗凝稀释的血液沿管壁滴入分离液试管中。放入离心机中，20 ℃条件下2 000 r/min 离心20 min。取出试管，将一毛细吸管伸入界面白色细胞层，将细胞吸出后移到另一试管中，加入1 ml Hanks液，悬浮细胞。

1.2.4 纯化T 细胞 将全血加入1 个离心管中，加入抗凝剂，在800 g、4 ℃下离心15 min，将血浆吸取至另一个洁净的离心管中，在56 ℃灭火30 min，再以相同的条件离心30 min，去除沉淀物，收集上清液完成分离。在一个洁净的试管中，用0.9%NaCl 溶液稀释全血，使其混合均匀，然后将上清液抽取到另一洁净的离心管中，加入分离液，将稀释过的全血铺在分离液液面上部，在300～500 g、20 ℃下离心30 min，直到形成白膜层，将白膜层抽取至一离心管中，加入0.9%NaCl注射液稀释至适当浓度，混合均匀后在400～500 g、20 ℃下离心10 min，弃上清液，再重复此过程，以清洗淋巴细胞；将细胞转移至离心管中，加入磁珠分离液重悬，根据每1×107个细胞对应2～20 µl CD3 reagent 的比例加入所需CD3 Reagent，混合均匀，在4 ℃下静置15 min，取出混匀后，在 300 g、20 ℃下离心10 min，弃上清液，加入磁珠分离液重悬，以此纯化T 细胞，采用层析柱分离出来，完成T淋巴细胞的纯化。

1.2.5 蛋白免疫印迹（Western blot）法检测经IL-17A 诱导后Jurkat T 细胞、HaCat 角质形成细胞、T细胞中IL-33、ST2L 蛋白表达水平 配制上层和下层胶并插入梳子，待胶凝固后加入5 µl 蛋白样品和Marker 进行电泳，电泳结束后取出凝胶，剪相应大小的PVDF 膜，加入电转液中进行电转，牛奶封闭，加入IL-33（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜，洗膜后分别加入二抗（1∶1 000）孵育1 h，采用化学发光法检测目的条带的灰度值，以目的蛋白与β-actin 灰度值比值作为蛋白表达水平。所有实验重复3次。

1.2.6 RT-PCR 测定经IL-17A、IL-33 诱导后Jurkat T 细胞、HaCat 角质形成细胞中IL-33 mRNA 表达

提取培养48 h 后Jurkat T 细胞、HaCat 角质形成细胞和各组T 细胞总RNA，逆转录合成 cDNA，目的基因IL-33正向引物：5´-AATCAGGTGACGGTGTTG-3´，反向引物：5´-TGAAACACAGTTGGAGTGC-3´；ST2L正向引物：5´-CCCACATTCAATAGGACTG-3´，反向引物：5´-AAGAGGTGCTGTCCAGTTG-3´；GAPDH 正向引物：5´-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3´，反向引物：5´-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3´。采用逆转录试剂盒将其逆转录得到cDNA。PCR 反应体系为25 µl，扩增条件为：95 ℃ 预变性 30 s，循环1 次；95 ℃ 变性5 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，95 ℃30 s，循环40 次。熔解曲线分析：将样品放置在67 ℃中保温15 s，接着以1 ℃/5 s 速度升温至95 ℃。利用EASY Dilution 将cDNA 溶液按10、100、1 000、10 000、100 000 梯度稀释（10 倍浓度稀释）后，各取2 µl 进行Real-time PCR 反应。20 µl PCR 反应液中cDNA添加量分别相当于重100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg 的总RNA 逆转录得到的cDNA 量。通过使用实时定量PCR 对各组细胞中IL-33、ST2L 和GAPDH基因表达进行实时定量分析，采用双标曲线法来评估相互关系。采用GAPDH 作为内参，各个样品的同一个基因经过3 次重复实验，并使用去离子水取代模板作阴性对照。计算出目的基因的相对表达量，采用2-ΔΔCt表示。

1.3 统计学分析 利用SPSS25.0 和GraphPad Prism 6 软件对数据进行统计分析并制图。采用Image J 软件计算免疫组化图片的光密度值和各种染色图片中阳性细胞数，计量资料以表示。当某一组样本量<5时，采用Fisher检验，结果方差齐两样本间比较采用t检验，多组间比较以方差分析q检验，相关分析采用Pearson 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果 在CON 组皮损组织中，IL-33蛋白仅少量表达于血管内皮细胞的细胞核中，表皮层中的角质形成细胞内无阳性表达，且ST2L 蛋白在CON 组的表皮角质形成细胞膜上无阳性表达，在真皮浸润的细胞膜上有极少量表达；在PV组和PP组患者的皮损中，IL-33及其受体ST2L蛋白在表皮和真皮细胞中均有不同密度的阳性染色，见图1。免疫细胞化学染色结果显示，IL-33 蛋白主要在HaCat 角质形成细胞的细胞核和部分胞质有表达，见图2。

图1 免疫组织化学染色检测各组皮损组织中IL-33及其受体ST2L表达Fig.1 Expressions of IL-33 and its receptor ST2L in each groups of skin lesions were detected by immunohistochemical staining

图2 免疫细胞化学技术检测HaCat角质形成细胞中IL-33的表达（×40）Fig.2 Expression of IL-33 in HaCat keratinocytes was detected by immunocytochemistry（×40）

2.2 Western blot 法检测经IL-17A 诱导Jurkat T 细胞中IL-33 蛋白表达 不同浓度IL-17A 诱导Jurkat T 细胞表达IL-33 蛋白量不同，呈剂量依赖性，见图3A；IL-17A（200 ng/ml）诱导Jurkat T 细胞表达IL-33蛋白量在24 h为最高，见图3B。

图3 Western blot 法检测经IL-17A 诱导Jurkat T 细 胞中IL-33蛋白表达Fig.3 Expression of IL-33 protein in Jurkat T cells induced by IL-17A was detected by Western blot

2.3 Western blot 法检测IL-17A 诱导HaCat 角质形成细胞IL-33 蛋白表达情况 不同浓度IL-17A 诱导HaCat 角质形成细胞表达IL-33 蛋白量不同，呈剂量依赖性，结果见图4A。不同浓度IL-17A 诱导HaCat角质形成细胞的细胞核表达IL-33 蛋白量呈浓度依赖性，结果见图4B。

2.4 Western blot法检测各组T细胞中IL-33蛋白表达量 与CON 组比较，PV 组、PP 组T 细胞中IL-33蛋白表达量差异有统计学意义（P<0.01），其中PP组表达量明显高于PV组，结果见图5。

图5 Western blot 法检测各组和CON 组T 细胞中IL-33蛋白表达量Fig.5 Expression of IL-33 protein in T cells in each group was detected by Western blot

2.5 Western blot 法检测IL-33 诱导Jurkat T 细胞后各组T 细胞中ST2L 蛋白表达情况 IL-33 诱导Jurkat T细胞后PV 组和PP组患者T细胞均可表达一定量ST2L 蛋白，呈剂量依赖性，见图6；PV 组和PP 组中ST2L 蛋白表达高于CON 组在同一浓度IL-33 诱导产生的ST2L 水平；其中PP 组在IL-33（100 ng/ml）和IL-33（200 ng/ml）浓度诱导下产生的ST2L 水平均高于PV组。

图6 Western blot 法检测IL-33 诱导Jurkat T 细胞后各组T细胞ST2L蛋白表达量Fig.6 Expression of ST2L protein in Jurkat T cells after IL-33 induction was detected by Western blot

2.6 RT-PCR 检 测IL-17A 诱 导Jurkat T 细胞后IL-33 mRNA 表达量 不同浓度IL-17A 诱导Jurkat T细胞后IL-33 mRNA 表达量不同，呈剂量依赖性，见图7A；IL-17A（200 ng/ml）诱导Jurkat T 细胞后在24 h时IL-33 mRNA表达量最高，见图7B。

图7 RT-PCR 检测IL-17A 诱导Jurkat T 细胞后IL-33 mRNA表达Fig.7 Expression of IL-33 mRNA in Jurkat T cells induced by IL-17A was detected by RT-PCR

2.7 RT-PCR检测IL-17A诱导后HaCat角质形成细胞中IL-33 mRNA 表达量 不同浓度IL-17A 诱导HaCat 角质形成细胞后IL-33 mRNA 表达量不同，且呈剂量依赖性，见图8。

图8 RT-PCR 检测IL-17A 诱导HaCat 角质形成细胞IL-33 mRNA表达量Fig.8 IL-33 mRNA expression in HaCat keratinocytes induced by IL-17A was detected by RT-PCR

2.8 RT-PCR 检测各组T 细胞中IL-33 表达情况PV组和PP组中IL-33 mRNA有明显表达，PP组表达量高于PV组，且均高于CON组，见图9。

图9 RT-PCR检测各组T细胞中IL-33表达量Fig.9 RT-PCR detected expression of IL-33 in T cells in each group

2.9 RT-PCR 检测IL-33 诱导Jurkat T 细胞后各组T细胞中ST2L mRNA 表达情况 不同浓度IL-33诱导Jurkat T 细胞后PV 组和PP 组患者的T 细胞均可表达一定量ST2L mRNA，呈剂量依赖性，PV组和PP组中ST2L mRNA 表达高于在同一浓度CON 组IL-33诱导产生的ST2L mRNA 水平，见图10A；以50 ng/ml终浓度IL-33 诱导各组细胞，从0 h 至12 h 各组细胞表达ST2L mRNA 呈上升趋势，12 h 至24 h 呈下降趋势，其中PV 组和PP 组表达ST2L mRNA 显著高于同一时间点CON组水平，见图10B。

图10 RT-PCR检测IL-33诱导Jurkat T细胞后各组T细胞中ST2L mRNA表达Fig.10 Expression of ST2L mRNA in Jurkat T cells after IL-33 induction was detected by RT-PCR

3 讨论

银屑病的确切病因尚未清楚，目前认为遗传因素与环境因素相互作用，从而导致银屑病发生或加重。TNF-α 和 IFN-γ 已被证实是银屑病发病的关键因子，与疾病的严重程度具有相关性［1-2］。目前临床上应用的生物制剂主要针对炎症因子包括TNF-α、IL-12/23和IL-17A 等。为了发现更多的银屑病治疗靶点，本研究对IL-33/ST2L 在银屑病发病机制的作用进行讨论。

IL-33 是IL-1 家族的新成员，研究表明IL-33 在体内多种细胞中均可表达，其在皮肤组织细胞中高表达的特性受到关注；同时IL-33 在多种自身免疫性疾病的发病中起重要的作用，包括银屑病、系统性红斑狼疮、特应性皮炎和系统性硬化症等［3］。本研究结果表明，在PV 组和PP 组皮损中，IL-33 及其受体ST2L 蛋白在表皮和真皮细胞中有不同密度的阳性染色，与ZENG 等［4］、DONG 等［5］的研究结果一致。IL-33 通过与其受体ST2L 结合转导信号于细胞内，其后通过下游的NF-κB 转录因子在细胞的增殖和分化中发挥重要的调节作用［6］。Th17 作为CD4+效应T细胞，可以分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等，研究发现IL-17A 是银屑病生理发病机制的关键，IL-17A具有诱导趋化、抑制中性粒细胞凋亡、促进新生血管形成、促进活化的角质形成细胞产生更多趋化因子、促进其他细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8）生成等作用［7］。IL-17A 能够诱导上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞合成分泌IL-6、IL-8 等炎症因子。角质形成细胞核中表达IL-33 受到IL-17A 刺激后可以通过一定的调节机制，发挥减弱免疫反应的作用［8］。Jurkat T细胞是来源于T 淋巴细胞和急性T 细胞白血病的细胞株，在血液病研究、基础免疫研究以及药理学研究方面有重要的作用［9］。人永生化角质形成细胞（HaCaT）的增殖、凋亡和炎症反应与银屑病的发生发展关系密切［10-11］。本研究结果发现Jurkat T 细胞、HaCat 角质形成细胞在IL-17A 诱导下IL-33 蛋白和IL-33 mRNA 呈高表达。IL-33 被认为具有抗炎和促炎作用，IL-33/ST2 轴在自身免疫性疾病中可以促进炎症细胞因子的释放，但在糖尿病等一些代谢性疾病中，IL-33 可被认为其发挥了抗炎细胞因子的作用［12］。本研究中Jurkat T细胞、PV组、PP组T细胞在IL-33 诱导下ST2L 蛋白和ST2L mRNA 呈高表达，与DONG 等［5］的研究结果一致。这些结果说明IL-33及其受体ST2L 在银屑病的发病机制中可能发挥了重要作用。

目前生物制剂治疗银屑病已取得良好的疗效，但在生物制剂治疗银屑病的过程中，患者发生湿疹样改变的情况也常有报道，其机制可能与免疫漂移、微生物定植、皮肤屏障破坏及遗传因素有关［13］。既往研究显示IL-33 及其受体ST2L 在AD 的发生发展过程中扮演重要角色，并且其在银屑病中也起重要作用，但是否是生物制剂引起免疫漂移的分子机制有待进一步研究［14］。本研究初步证实了IL-33 及其受体ST2L表达与银屑病发生发展密切相关，但在本研究中由于病例数量较少，尚未对关节病型银屑病和红皮病型银屑病患者外周血T细胞和皮损进行相关检测，故结果可能存在一定局限性，未来需要扩大样本量，并且对各种类型银屑病及其严重程度与IL-33/ST2L的相关性进行更加深入的研究。从而进一步明确IL-33/ST2L 受体与银屑病的发生、发展的关系，探讨其信号转导通路，为治疗银屑病寻找新的靶点。