HCST作为1型糖尿病潜在分子标志物的筛选和机制探究①

侯永旺 杨志聪 史 丽（河北北方学院附属第一医院，张家口 075000）

1 型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是儿童最常见的慢性病之一，最常见的发病年龄为4～6岁和青春期早期（10～14岁）。T1DM的发病率和患病率一直稳步上升，占糖尿病患者的5%～10%。在世界范围内，发病率也存在相当大的地域差异。据报道，发病率最高的是芬兰和其他北欧国家，其发病率约是报告发病率最低的中国和委内瑞拉的400倍［1-3］。在T1DM中，胰岛中的β细胞在数月或数年内被免疫破坏，导致胰岛素绝对缺乏。目前研究人员认为该病存在遗传倾向，与特定HLA（DR 和DQ）等位基因密切相关，且T1DM 具有家族遗传倾向［4-8］。目前公认的T1DM 与自身免疫应答密切相关，最近有学者发现miR-150 缺失通过细胞免疫应答促进T1DM 发生，TNFSF14在STZ 诱导的T1DM 中发挥重要作用，其可能通过下调CD4+FoxP3+Treg 分化介导T1DM 发生，这些研究说明免疫应答异常与T1DM 密切相关［9-10］。现有的预测T1DM 的主要血清标志物包括抗β细胞自身抗体、抗胰岛素的自身抗体（IAA）、抗胰岛素瘤相关抗原-2 的自身抗体（IA-2）、抗谷氨酸脱羧酶的自身抗体（GAD）、抗锌转运蛋白8的自身抗体（ZnT8）和胰岛细胞抗体（ICA），但有些抗体的阳性率不是很高［11-13］。因此探寻新的分子标志物对于T1DM的预测和诊断治疗具有重要意义。

本文主要通过生物信息学手段筛选出T1DM 患者中的71 个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），最终确定免疫相关基因造血细胞信号转导子（hematopoietic cell signal transducer，HCST）为T1DM 的关键基因。研究发现HCST 可以编码跨膜信号适配器，并与C型凝集素样受体NKG2D 形成免疫识别受体复合物，该复合物可能通过激活树突状细胞（dendritic cells，DCs）、自然杀伤（natural killer，NK）细胞和T 细胞在细胞的存活和增殖中发挥作用［14-15］。因此，HCST 可能是T1DM 的有效分子标志物。

1 资料与方法

1.1 资料 从GEO 数据库搜索T1DM 和健康人群的外周血单个核细胞微阵列表达数据。通过筛选得到GPL570 平台的GSE55098 数据集。该数据集中各包含10例健康人群和12例T1DM。

1.2 方法

1.2.1 筛选DEGs 从GEO 数据库下载矩阵文件，借 助GEO2R 分 析DEGs（P<0.05，log2|FC| ≥1）。RStudio 软件加载“gplots”“heatmap”“ggplot2”做热图和火山图可视化分析。

1.2.2 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络和关键基因筛选 利用String（https：//string-db.org/）对DEGs 进行PPI 分析，设置combined sore>0.4对分析结果进行筛选，并利用Cytoscape 软件（v3.8.0）进行可视化。采用MCODE 插件对PPI 进行加权网络分析，筛选关键的子网络和基因，并对子网络做富集分析。利用cytoHubba 插件对PPI 网络进行关键基因筛选，对4 种计算方式［MCC（maximun clique centrality）、DMNC（maximum neighborhood component）、MNC（maximun neighborhood component）和Degree］得到的前5 个关键基因进行Venn分析，确定最终的关键基因。

1.2.3 富集分析 借助DAVID 在线分析工具对PPI子网络基因进行GO（gene ontology）分析［包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）］和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。富集分析的结果通过在线网站（http：//www.bioinformatics.com.cn）进行可视化。

1.3 统计学处理 使用GraphPad Prims 9 软件对两组关键基因表达量进行统计分析和受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，两组间比较采用t检验，P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选DEGs 通过P<0.05 和log2|FC|≥1 的条件对GSE55098 数据集进行筛选，T1DM 与对照组相比共得到71 个DEGs，其中有上调基因22 个，下调基因49个（图1）。

图1 DEGs的筛选Fig.1 Screen of DEGs

2.2 PPI 网络构建及子网络功能富集 PPI 分析结果显示，String 设置0.4 的PPI 信任值，且仅显示27 个节点，58 个互作关系（图2A）。利用MCODE 插件筛选1 个关键子网络，得分7.5，共有9 个节点和30 个互作关系（图2B）。通过对子网络的9 个基因进行GO 和KEGG 富集分析发现，这9 个基因主要参与调节免疫反应、细胞的防御反应、免疫应答及细胞溶解的生物过程，涉及的主要信号通路是NK 细胞介导的细胞毒作用的信号通路（图2C、表1）。

表1 GO和KEGG富集分析Tab.1 GO and KEGG enrichment analysis

图2 PPI网络构建及子网络功能富集Fig.2 PPI network construction and subnetwork function enrichment

2.3 关键基因筛选 MCC 算法得到前5 个关键基因为有PRF1、CCL4、KLRD1、HCST 和GNLY；DMNC算法得到的前5 个关键基因为HCST、GNLY、GZMH、NKG7 和NCAM1；MNC 算法得到的前5 个关键基因PRF1、KLRD1、CCL4、NKG7 和HCST；Degree算法得到的前5 个关键基因为PRF1、CCL4、KLRD1、NKG7 和HCST（图3A）。4 种算法得到的关键基因通过Venn 分析最终筛选出1 个关键基因，即HCST（图3B）。

图3 关键基因筛选Fig.3 Screen of hub genes

2.4 HCST 在T1DM 中的表达量及ROC 曲线 对GSE55098 数据集中10 例健康人群和12 例T1MD 患者的HCST 表达量进行对比分析，结果显示HCST 在T1DM 组的表达量明显低于健康对照组，差异有统计学意义（图4A）。HCST 的ROC 曲线分析结果显示曲线下面积为0.983 3，P=0.0001，差异有统计学意义（图4B）。

3 讨论

T1MD 是由胰腺β 细胞与免疫系统间的复杂相互作用所引起。但是机体中针对β细胞的免疫反应是随机的还是存在诱发因素尚存在争议［16-17］。一种长期存在的假说认为，病毒感染是T1DM 自身免疫反应的潜在触发因素。在病毒中，肠道病毒是研究最多的。糖尿病预测与预防研究证实了肠道病毒感染与第1个自身抗体出现间的关系［18］。但目前大多数对于T1DM 免疫功能障碍的研究集中在下游T细胞和B 细胞的适应性反应，而忽视了上游先天参与者如NK细胞的作用。研究发现，与T1DM 有关的许多病毒是慢性潜伏或溶原性感染，它们通过类似于妊娠耐受的机制降低NK细胞的反应和数量。NK细胞对感染的抑制反应导致不正确的信号传导，这种不适当的抗原呈递导致了CD8+淋巴细胞的增殖和细胞毒性［19-20］。

NK 细胞对病原体做出反应并直接将其杀死，此外，NK 细胞还参与了适应性免疫反应的强度和精细控制。最近的研究表明，NK 细胞控制下游反应的效应和抑制活性，包括激活或杀死抗原提呈细胞和Treg、细胞毒性T 淋巴细胞（CTLs）、T 辅助细胞（Th）和B 细胞［21-23］。NK 细胞的作用是调节细胞毒性CD8+T 淋巴细胞反应，从而控制异常或慢性炎症反应，避免未识别的细胞和组织遭到破坏［24］。EB病毒被证明能有效抑制NK 细胞，从而抑制NK 细胞对细胞毒性CD8+T 淋巴细胞反应的调节［25-26］。研究发现，在NOD 模型中，NK 细胞介导CD8+细胞毒性T 淋巴细胞的破坏可改善自身免疫性糖尿病［27］。

本文通过筛选GSE55098 数据集中T1DM 的差异基因并构建PPI网络，借助MCODE 插件筛选关键子网络，通过对子网络基因功能富集分析发现HCST及相关基因主要富集在NK 细胞导致的细胞毒信号途径，并参与调节免疫反应、细胞的防御反应、免疫应答及细胞溶解的生物过程。同时，本研究结果表明HCST 在T1DM 中表达量显著降低。因此课题组认为HCST 基因的降低引起了NK 细胞参与的固有免疫及相关信号通路的功能发生紊乱，这使得在发生病毒感染或存在其他诱导因素的情况下，NK 细胞的错误递呈作用导致了异常的细胞毒作用，最终胰岛β 细胞遭到慢性损伤并导致T1DM 发生。这些结果与BAYER 等［19］的观点相似，进一步证实了本研究结果。ROC 曲线结果表明，HCST 可以成为诊断T1DM的潜在分子标志物。

综上所述，HCST 在T1DM 中表达量降低，或可成为诊断T1DM 的潜在分子标志物。此外，HCST 引起了NK 细胞参与的固有免疫及相关信号通路的功能紊乱，导致T1DM 发生，因此HCST 可能成为治疗T1DM的潜在靶点。