人参皂苷衍生物AD-1 通过抑制NLRP3 炎症小体活化改善TNBS 诱导的小鼠急性IBD①

苏 超 包 阔 李佳威 黄胜男 韩园园 姜天意 朱婧尧 李芳芳 金 丹

（延边大学医学院免疫学与病原生物学重点实验室，延吉 133002）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn´s disease，CD），是肠道的慢性炎症性疾病，其发病率呈上升趋势，病因尚不明确，但一般认为其是遗传、环境、肠道微生物群和免疫异常引起的多因素疾病［1-2］。如果控制不好，随着时间的推移，复发的炎症可能会导致严重的后果，如组织纤维化、瘘管甚至癌变［3-4］。用于治疗IBD 的药物主要有5-氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫抑制剂等，尽管种类繁多，但副作用明显、不能长期使用等问题限制了其应用［5-6］。

人参作为一种传统的中草药，已被广泛用于保健和治疗某些慢性病［7］。人参皂苷为人参的主要活性成分，具有降血糖、抗癌、抗氧化、抗炎和神经保护活性的作用［8］。AD-1［20（R）-25-甲氧基-达玛烷-3β，12β，20-三醇］是从人参果实中提取的新型人参皂苷衍生物。课题组前期工作发现AD-1 有减轻葡聚糖硫酸钠（dextra sulfate sodium，DSS）诱导的慢性IBD小鼠肠道炎症的作用，但对TNBS诱导的小鼠急性IBD模型的相关研究尚未见报道。关于人参抗炎机制方面，有研究表明人参皂苷Rk3 通过保护结肠屏障和抑制NLRP3 炎症小体通路减轻小鼠IBD［9］。人参皂苷Rd 通过抑制NLRP3 炎症小体活化改善IBD［10］。基于以上研究背景，探讨AD-1 是否对急性IBD 具有治疗作用，以及改善小鼠结肠炎症程度的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8 周龄的雄性C57BL/6 小鼠（合格证号：202200042522）购于延边大学实验动物研究中心，在恒温20～25 ℃条件下饲养，光/暗周期为12 h。该实验操作严格遵守延边大学动物实验管理委员会相关规定。本实验通过延边大学实验动物福利伦理委员会审查（YD20230912001）。

1.1.2 主要试剂 AD-1由沈阳药科大学赵余庆教授馈赠；TNBS（P2297）购于美国Sigma 公司；Oligo（dT）（C1101）购于美国Promega 公 司；rTaq 酶（R500Z）购于日本TaKaRa 公司；PCR 引物由Invitrogen 公司合成；Caspase-1（ab179515）、NLRP3（ab214185）、IL-18（ab207323）、ZO-1（ab276131）、Occludin（ab216327）等一抗购于美国Abcam 公司；ASC（67824S）、IL-1β（12703S）、IL-6（12912S）、TNF-α（11948S）、β-actin（8457S）等一抗购于美国CST公司；HRP 标记的山羊抗兔IgG 二抗（ZB-2301）购于中国中杉金桥公司；羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）购于上海麦克林生化科技股份有限公司（C798844）；ELISA试剂盒购于上海酶联公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性IBD 模型的建立 6～8 周龄的雄性C57BL/6 小鼠随机分为正常对照组（Control）、乙醇对照组（Alcohol）、模型组（TNBS）、治疗组（TWBS+AD-1）和阳性对照组（TNBS+5-ASA），每组10只，后3组于造模前7 d采用1%TNBS 乙醇溶液涂抹皮肤进行预敏化处理，即先将小鼠进行剃毛处理，暴露出皮肤，每日在皮肤同一区域上进行涂药，每只小鼠涂抹0.1 ml。造模日于禁食12 h 后采用2.5%TNBS 乙醇溶液灌肠给药建立急性IBD 模型，本实验根据2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）报道的方案进行了一些修改［11-13］，并通过课题组前期预实验的摸索来制定此造模方案。灌肠前用乙醚进行麻醉，然后将一根柔性导管插入肛门到达结肠部位，每只小鼠注入100 µl，正常对照组和乙醇对照组采用上述同样的方法，灌入相同体积的生理盐水和25%乙醇溶液，全程进行1 次灌肠操作处理。治疗药AD-1（10 mg/kg）和阳性对照药物5-ASA（30 mg/kg）分别溶于0.5%CMC 中，于灌肠造模后的第2天进行灌胃给药，正常对照组和乙醇对照组分别灌胃CMC，每只小鼠灌胃200 µl，灌胃时间为连续4 d，第6天处死小鼠。

1.2.2 小鼠疾病活动指数（disease activity index，DAI）［14］对整个实验期间小鼠的体质量、粪便性状及血便情况进行观察并记录，粪便正常计0分，粪便软并带有潜血计1 分，粪便松散并带血计2 分，腹泻并便血计3 分。体质量不下降计0 分，体质量下降1%～5%计1分，体质量下降5%～10%计2分，体质量下降10%～15%计3 分（DAI=体质量变化评分+粪便形状及血便评分）。

1.2.3 苏木素-伊红（hematoxylin eosin，HE）染色法检测小鼠结肠组织的病理变化 第6天脱颈处死小鼠，取小鼠结肠组织采用10%甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片厚度为4 µm，HE 染色后，显微镜观察小鼠结肠组织病理的变化。

1.2.4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测结肠组织炎症因子基因的表达 采用TRIzol裂解液裂解结肠组织提取总RNA，合成cDNA，按照95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；58 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；72 ℃ 5 min；35个循环的程序进行DNA扩增，配制1.5%琼脂糖凝胶，电泳，全自动成像仪显影，采用Image J 软件分析条带密度。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 Western blot 法检测结肠组织相关蛋白表达 采用RIPA 裂解液裂解结肠组织提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，10%SDS-PAGE 凝胶电泳下分离蛋白质，转移到PVDF 膜上，室温下于5%脱脂牛奶中封闭1 h，在4 ℃下与一抗孵育过夜，然后用1×TBST 洗膜4 次。室温下与二抗孵育1 h，1×TBST洗膜4 次，凝胶成像仪显影拍照。Image J 软件分析条带密度。

1.2.6 ELISA 检测小鼠血清中细胞因子的含量

第6天脱颈处死小鼠前取小鼠眼球血并分离出血清，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，将待测样品和标准品加入96 孔板，加入酶标记抗体工作液，37 ℃孵育1 h，然后弃去液体，洗板5次，加入显色剂15 min 后，加入终止液，用酶标仪在450 nm 波长处测量各孔的OD值，最后计算出样品的浓度。

1.3 统计学分析 采用Graphpad prism7 软件进行统计学处理。所有数据以表示，组间均数差异比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠DAI 评分和结肠长度的影响 在实验过程中动态监测小鼠DAI评分，与TNBS 组［（5.84±0.06）分］比较，TNBS+AD-1 组［（3.84±0.05）分］和TNBS+5-ASA 组［（4.3±0.08）分］小鼠在第4 天DAI 评分显著降低（P<0.01）。AD-1 可以减轻TNBS 诱导的急性IBD 小鼠腹泻、血便情况（图1A）。实验结束后，收集小鼠的结肠测量结肠长度，Control 组平均结肠长度为（7.57±0.05）cm，Alcohol 组平均结肠长度为（7.47±0.05）cm，TNBS组平均结肠长度为（5.67±0.12）cm，TNBS+AD-1 组平均结肠长度为（6.77±0.12）cm，TNBS+5-ASA 组平均结肠长度为（6.64±0.09）cm。与Control组和Alcohol组相比，模型组小鼠结肠长度明显缩短（P<0.001）；与模型组相比，AD-1+TNBS组和5-ASA+TNBS 组小鼠结肠长度增加，差异有统计学意义（P<0.01）。AD-1 可以改善TNBS 诱导的急性IBD小鼠结肠长度缩短的情况（图1B）。

图1 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠DAI 评分和结肠长度的影响Fig.1 Effects of AD-1 on DAI score and colon length in TNBS-induced acute IBD mice

2.2 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织炎症病理影响 HE 染色生物光学显微镜，与正常组和乙醇对照组相比，模型组炎症细胞浸润增加，上皮缺失、隐窝结构破坏增加以及杯状细胞减少；与模型组相比，AD-1治疗组和阳性对照组小鼠结肠炎症病理有较好的改善（图2）。

图2 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织炎症的病理影响Fig.2 Effect of AD-1 on inflammatory pathology of colon tissue in TNBS-induced acute IBD mice

2.3 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织中促炎细胞因子的影响 与正常组和乙醇对照组相比，模型组结肠组织IL-6、TNF-α 表达水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.001）；与模型组相比，治疗组和阳性对照组的细胞因子IL-6、TNF-α 表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。AD-1 可下调促炎因子的表达，改善TNBS 诱导的小鼠急性IBD（图3）。

图3 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织中促炎细胞因子的影响Fig.3 Effects of AD-1 on tissue proinflammatory cyto kines in colon of TNBS-induced acute IBD mice

2.4 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织ZO-1 和Occludin 蛋白表达的影响 与正常组和乙醇对照组比较，模型组ZO-1 和Occludin 表达明显降低（P<0.001）；与模型组相比，治疗组ZO-1 和Occludin 的表达升高，差异有统计学意义（P<0.01）；阳性对照组ZO-1 与模型组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。如图4。提示AD-1 具有促进TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织中ZO-1 和Occludin 蛋白恢复的作用。

图4 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织ZO-1和Occludin蛋白表达的影响Fig.4 Effects of AD-1 on expressions of ZO-1 and Occludin proteins in colon tissue of TNBS-induced acute IBD mice

2.5 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠结肠组织NLRP3 炎症小体以及IL-1β、IL-18 表达的影响 与正常组和乙醇对照组比较，模型组ASC、Caspase-1、NLRP3 的表达水平明显升高（P<0.001）；与模型组相比，治疗组和阳性对照组的表达水平降低，差异有统计学意义（P<0.01）。表明AD-1 可抑制NLRP3炎症小体的激活（图5A、B）。与正常组和乙醇对照组相比，模型组IL-1β、IL-18 的表达水平显著升高（P<0.001）；与模型组相比，治疗组和阳性对照组IL-1β、IL-18 的表达水平降低，差别有统计学意义（P<0.01）。AD-1 可能通过抑制NLRP3 炎症小体进而下调下游炎症细胞因子的表达水平（图5C、D）。

2.6 AD-1 对TNBS 诱导的急性IBD 小鼠血清中IL-1β 和IL-18 的影响 模型组小鼠血清中IL-1β、IL-18 含量高于正常组和乙醇对照组（P<0.01，P<0.05）；治疗组和阳性对照组小鼠血清中IL-1β、IL-18表达下降，差异有统计学意义（P<0.05）。AD-1 可能通过降低TNBS诱导的急性IBD小鼠血清中IL-1β和IL-18水平，改善小鼠的急性炎症（图6）。

3 讨论

IBD 是一种病因和发病机制尚不清楚的慢性非特异性肠道疾病，其特点是炎症无法消退，可导致肠道纤维化、狭窄甚至梗阻［15］。IBD 在工业化国家的发病率正在稳步上升，而发展中国家的发病率在过去几十年里迅速上升［16］。该病发病机制与肠道中上皮屏障、共生菌群、抗原识别、免疫反应失调、白细胞募集和遗传等因素相关［17］。通过将化学物质TNBS 输送到小鼠体内所建立的结肠炎症模型，其临床表现与人类的IBD相似，如进行性体重减轻、腹泻、便血、肠道破坏，肠壁增厚、弥漫性坏死和肠道中性粒细胞浸润等［18］。

人参皂苷是人参的主要成分之一，已被证实具有良好的抗炎和抗肿瘤作用［19-20］。人参皂苷在治疗IBD 方面已有较多的研究报道，如人参皂苷Rd 通过NF-κB 通路抑制小鼠促炎细胞因子的产生，减轻DSS 诱导的小鼠IBD［21］。人参皂苷Rh2 通过调节STAT3/miR-214 通路缓解DSS 诱导的小鼠IBD［22］。人参皂苷Rg1 通过调节Tfh/Treg 细胞的平衡缓解TNBS 诱导的小鼠IBD［23］。人参皂苷Rb1 通过激活内质网驻留的E3 泛素连接酶Hrd1 信号通路减轻TNBS 诱导的小鼠IBD［24］。课题组前期工作中发现AD-1 对DSS 诱导的慢性IBD 小鼠有减轻肠道炎症作用，但对于TNBS诱导的小鼠急性IBD模型的相关研究尚未见报道，因此建立TNBS诱导的急性IBD小鼠模型，探讨AD-1对其的影响及相关机制。结果显示，模型组小鼠的DAI评分明显增加，包括小鼠体质量减轻、腹泻及便血情况；模型组小鼠结肠长度明显缩短，结肠黏膜严重的水肿、坏死、杯状细胞减少以及炎症细胞浸润。而AD-1 和5-ASA 处理的小鼠体质量上升，肠道内容物检查所见，粪便颗粒结构良好，结肠长度明显增加，结肠组织病理得到较好的改善。以上结果证明人参皂苷AD-1可改善TNBS诱导的小鼠结肠炎的临床表现，包括体质量减轻、腹泻、结肠缩短和组织病理学损伤。

TNF-α 和IL-6 在IBD 的病理生理过程中起重要作用［25］。可调节黏膜免疫系统，改变上皮完整性，协调中性粒细胞和巨噬细胞的浸润和激活，从而导致结肠损伤。有研究报告，TNF-α 和IL-6 高表达可能导致UC 患者黏膜屏障功能缺陷，从而加剧组织炎症。同时观察到UC患者血清中，TNF-α和IL-6水平也明显升高［26］。GUPTA 等［27］研究表明使用IL-6单克隆抗体（mAb）或TNF-α mAb 可显著降低肠道通透性，改善DSS 诱导的小鼠急性IBD。本实验研究结果表明，与模型组相比，治疗组IL-6和TNF-α表达水平降低，提示AD-1可通过下调促炎细胞因子的表达，改善TNBS诱导的小鼠急性IBD的炎症反应。

肠上皮屏障将内环境与外环境隔离，在肠内稳态中起至关重要的作用。肠道炎症与肠屏障损伤引起的肠黏膜通透性增加有关［28］。Occludin和ZO-1是肠道重要的紧密连接蛋白，参与肠上皮细胞的增殖和分化等过程［29］。由于氧化应激或炎症反应的增加，导致肠道通透性增加和肠道屏障被破坏，这是IBD的重要致病因素［30］。本次研究结果观察到模型组小鼠结肠组织Occludin 和ZO-1 表达明显降低，治疗组Occludin 和ZO-1 表达升高，提示AD-1 对肠道屏障的损伤具有保护作用。

NLRP3 炎症小体是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis associated speck-like protein，ASC）和半胱氨酸天冬氨酸酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）组成炎症小体复合物。NLRP3受到活化信号后，pro-caspase-1 水解为酶活性的Caspase-1，Caspase-1 切 割pro-IL-1β 和pro-IL-18 使其成为活化状态的IL-1β 和IL-18 进而引发系列炎症反应［31］。人类标本和小鼠结肠炎模型的数据表明，IL-1β 和IL-18 过度表达在IBD 的发病机制中起关键作用［32］。因此，抑制NLRP3 炎症小体的活性可以有效地抑制炎症发展，缓解IBD 的炎症反应［33］。同样，本实验发现，模型组结肠组织中NLRP3 炎症小体、IL-1β、IL-18蛋白表达明显升高，血清中IL-1β、IL-18 高表达，而治疗组小鼠结肠组织中NLRP3 炎症小体、促炎细胞因子以及血清中IL-1β、IL-18表达显著下降，小鼠急性IBD 得到缓解。表明AD-1可通过抑制NLRP3 炎症小体的活化进而下调下游细胞因子IL-1β、IL-18 表达，改善TNBS 诱导的小鼠急性IBD。

综上所述，AD-1 可能是通过抑制NLRP3 炎症小体活化，缓解TNBS诱导的IBD模型小鼠炎症反应作用。提示AD-1 治疗IBD 控制其急性炎症作用值得进一步研究。本研究结果将会为研发新的治疗IBD 药物方面提供实验依据，也为研究人参皂苷应用于炎症性疾病的治疗提供新的思路。