基于网络药理学分析冬虫夏草防治急性肾损伤的分子机制①

洪 涛 李晓宇 李尚妹 刘华锋③（广东医科大学附属医院肾内科，湛江 524000）

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）是多种原因造成的肾功能急性下降，是临床常见危重症。据报道，AKI 患病率为1.0%（社区）～7.1%（医院），医院获得性AKI病死率为40%～80%，需要肾脏替代治疗的AKI 病死率高达80%［1］。存活的AKI 患者部分经治疗后逐步恢复肾功能，但仍有少部分AKI 患者病情迁延转化为慢性肾脏病甚至演变为终末期肾脏病，需终身肾脏替代治疗。可见AKI 已成为严重威胁公共健康的问题。

尽管近年针对AKI 发病机制、诊断等有许多研究，但防治方面并无突破。目前AKI 治疗包括纠正可逆病因、维持液体电解质平衡、必要时肾脏替代治疗等；尚无循证医学证据显示某个现代药物防治AKI效果确切。近年中医药对AKI的防治研究取得了一些可喜进展。一些单味中药及其提取物可用于AKI 的动物实验或临床研究，冬虫夏草（Cordyceps sinensis，CS）是较早用于AKI 临床及动物实验的中药之一［2］。

CS 味甘性温，归肺肾二经，具有补肺益肾作用。目前临床多以人工发酵生产的菌丝体代替野生CS用于多种肾脏疾病治疗。近年多个研究报道CS 在AKI 动物模型中具有减轻肾损伤的作用［3-4］。也有多篇CS 制剂在AKI 应用的临床研究报道［5］。课题组前期曾做过AKI 患者CS 制剂的临床应用效果系统评价，提示CS 制剂可改善AKI 患者肾功能，促进肾小管功能恢复，从而改善临床治疗效果［6］。本研究采用网络药理学方法挖掘CS 多成分、多靶点、多通路防治AKI 的分子机制，为进一步研究中药防治AKI的作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 CS 有效活性成分筛选 通过中药系统药理学数据库和生物信息学分析工具TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php）筛选CS 的化学成分。根据TCMSP 数据库建议的筛选条件（https：//old.tcmsp-e.com/load_intro.php？id=29）并参考既往文献，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件［7-8］，得到CS的口服有效活性成分；同时查阅CNKI 及Pubmed 中关于CS的中英文文献，得到其有效单体成分数据信息，最终确定CS口服有效活性成分纳入后续分析。

1.2 CS 活性成分作用靶点预测 通过TCMSP 数据库检索以上活性成分对应靶点，并通过Uniprot（http：//www.uniprot.org）数据库将靶点蛋白转化为相应基因名。

1.3 AKI 相关疾病靶点数据构建 在DisGeNET（http：//www.disgenet.org/home）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）4 个数据库中检索“acute kidney injury”，检索人类AKI 相关基因，得到AKI治疗靶点。

1.4 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建 将CS成分靶点基因数据集与AKI相关靶点基因数据集进行对比分析，取二者重叠，得到CS 作用于AKI 的靶点数据集，并以Venn 图形式绘制。通过STRING 数据库（http：//string-db.org）构建CS 有效成分作用于AKI靶点的相互作用网络图。

1.5 药物疾病靶网蛋白相互作用筛选 通过Cytoscape 3.8.0 对各味中药“活性成分-AKI 疾病靶点网络”蛋白互作关系进行分析，得到靶蛋白度值，筛选得到核心蛋白互作网络图。

1.6 基因功能聚类和富集分析 DAVID 是高通量的生物数据功能挖掘工具，旨在系统全面地为大规模基因或蛋白列表提供生物学意义，可对单个基因进行分析注释构建GO 富集，包括生物学过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞成分（cellular component，CC）。将CS 与AKI 共同靶点数据集信息导入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）进行GO 富集分析，得到显著富集的主要功能注释。KEGG 数据库整合了基因组、化学和系统功能信息，最核心的是KEGG PATHWAY数据库，可利用图形介绍众多信号通路及各通路间的关系。将CS 与AKI 共同靶点数据集信息导入KEGG 数据库（https：//www.kegg.jp）进行“药物-AKI疾病作用靶点”通路富集分析，得到显著富集的信号通路。

2 结果

2.1 CS有效活性成分筛选及靶点预测 在TCMSP数据库中以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，得到CS有效化合物7 个：arachidonic acid（花生四烯酸，TCMSP 数据库分子号：MOL001439）、Linoleyl acetate（乙酸亚油醇酯，TCMSP 数据库分子号：MOL0-01645）、beta-sitosterol（β-谷甾醇，TCMSP 数据库分子号：MOL000358）、Peroxyergosterol（过氧麦角甾醇，TCMSP 数据库分子号：MOL011169）、cerevisterol（酒酵母甾醇，TCMSP 数据库分子号：MOL008998）、cholesteryl palmitate（胆甾醇软脂酸酯，TCMSP 数据库分子号：MOL008999）、CLR（胆甾醇，TCMSP 数据库分子号：MOL000953）；查阅既往文献发现许多研究认为虫草素是CS 的主要活性成分，具有抗肿瘤、免疫调节、保护肾脏等药理学活性［9-11］。虫草素及其异构体在TCMSP 数据库中的分子编码为MOL00-9000、MOL009001，OB 均>30%，但DL 分别为0.16及0.17，故以DL≥0.18 为筛选条件时未将其纳入筛选结果，为避免遗漏重要成分，将这两个分子一并纳入分析。以上9 种有效活性成分中仅有6 种在TCMSP 中有对应作用靶点，其他3 个有效成分目前在数据库中无对应靶点信息，对应靶基因共84 个（图1）。

2.2 AKI 相关靶点数据构建 在DisGeNET 数据库、GeneCards、OMIM、TTD 数据库检索人类AKI 相关基因，获得AKI治疗靶点信息。其中DisGeNET数据库以Score≥0.8 为筛选条件得到1 148 个基因信息，GeneCards 以relevance Score≥1 得到7 149 个基因信息，OMIM 得到93 个基因信息，TTD 得到2 个基因信息。利用R 软件将以上4 个数据库所得AKI 相关靶标信息取并集，共得到7 370 个基因信息，Venn图见图2。

图2 DisGeNET、GeneCards、OMIM、TTD 4 个数据库的AKI相关靶基因数据集合Fig.2 AKI-related target genes got through DisGeNET，GeneCards，OMIM and TTD databases

2.3 CS-AKI共同靶点数据构建 使用R语言将CS的有效成分靶点基因数据集与AKI相关靶点基因数据集进行对比，取交集，得到CS 作用于AKI 的靶点数据集，共63个基因信息，Venn图见图3。

图3 CS有效成分与AKI作用靶点交集Venn图Fig.3 Venn diagram of CS bioactive components and AKI-related genes

2.4 CS活性成分-AKI相应靶点调控网络构建 运用Cytoscope3.8.0 软件构建中药“活性成分-靶点”网络，可见CS 中6 种有效成分通过网络协同作用于63个靶标发挥对AKI的作用（图1）。

2.5 CS-AKI 共同靶点的PPI 网络构建与核心靶点筛选 将上述共同靶点导入String数据库评估蛋白-蛋白互作信息，以相互作用分值可信度（interaction score confidence≥0.9）为筛选条件，隐藏与其他基因无相互作用的靶点，构建靶点蛋白-蛋白互作网络图（图4），节点表示靶点蛋白，每条边表示靶点蛋白间的相互作用，线条越多表示关联度越大。借助Cytospace 计算连接节点数最多的基因，前10 位核心基因为RXRA、MAPK1、CASP3、CASP8、TNFRSF1A、RELA、JUN、PRKCA、TGFB1、PPARG，核心靶标网络见图5。

图4 CS与AKI共同靶点的蛋白互作网络Fig.4 Protein-protein interaction network of CS and AKI targets

图5 CS与AKI核心靶点的网络图Fig.5 Network of CS and AKI core targets

2.6 GO 功能富集分析 将CS 作用于AKI 的靶点导入DAVID 数据库平台进行GO 富集分析，CS 对AKI 作用的BP 主要富集于细胞增殖调控、细胞凋亡、炎症反应、衰老等（表1）。应用R 语言根据Enrichment score（-logP）对富集的前10 个BP、CC、MF进行柱状图可视化（图6）。

表1 CS作用于AKI的GO聚类富集结果（前17位）Tab.1 GO enrichment of CS in treatment of AKI（Top 17）

图6 GO富集分析Fig.6 GO enrichment analysis

2.7 KEGG 功能富集分析 将药物与疾病交集靶点导入KEGG 数据库进行KEGG 通路富集分析，共得到143条信号通路，主要富集通路见表2。对其中的PI3K-Akt 信号通路进行可视化以呈现靶点及其上下游分子的调控关系（图7）。

表2 CS防治AKI的KEGG主要富集通路Tab.2 KEGG enrichment pathway of CS protecting AKI

图7 PI3K-Akt信号通路中CS作用于AKI的靶点分布图Fig.7 Target distribution map of CS acting on AKI in PI3K-Akt signaling pathway

3 讨论

网络药理学近年已成为中药药理学的研究热点，从分子水平预测药物治疗疾病的靶点、通路，揭示中药治疗疾病多通路多靶点起作用的复杂方式。本研究运用该方法分析CS防治AKI的分子机制，构建相应的“药物-成分-靶点-疾病”作用网络图以及这些潜在靶点蛋白间相互作用的网络图，并对治疗靶点进行了GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。CS 主要有9 种有效活性成分：TCMSP 数据库分子号分别为MOL001645、MOL000358、MOL001439、MOL000953、MOL011169、MOL008998、MOL008999、MOL009000、MOL009001，通过63 个靶点发挥对AKI的防治作用。

本研究发现CS保护AKI的核心靶点主要包括：

RXRA、MAPK1、CASP3、CASP8、TNFRSF1A、RELA、JUN、PRKCA、TGFB1、PPARG，这些靶点可能通过影响对药物的反应、信号转导、衰老调控、细胞增殖和凋亡调控、炎症反应、对缺氧的反应等参与AKI发生。

本研究发现CS 作用于AKI 的靶点富集通路主要包括：PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、细胞凋亡通路、TNF 信号通路、P53 信号通路、HIF-1 等，可能涉及细胞生长与凋亡、炎症反应、细胞自噬、铁死亡等多种生物学过程。其中PI3K-Akt 信号通路是富集程度较高的通路和关键信号通路。近期CS药理作用及机制研究发现CS 可通过调控NF-κB 通路发挥抗肿瘤作用［12］；可通过抑制PI3K-Akt 通路调节肾小管上皮细胞凋亡［13］；通过调控mTOR 通路诱导肿瘤细胞凋亡和自噬［14］；通过Nrf2 调控HO-1 通路增强肺上皮细胞对缺氧的耐受性［15］。这些体内外研究报道与本研究结果一致，表明CS对肾脏保护作用的分子机制值得进一步研究和系统挖掘。

PI3K 是由调节亚基P85 和催化亚基p110 构成的二聚体，与生长因子受体结合可改变Akt 蛋白结构并使其活化，并以磷酸化作用激活或抑制下游一系列底物，如凋亡相关蛋白Bad/Caspase9活性，从而调节细胞增殖、分化、凋亡及迁移等生物学行为。Akt 也可激活IKK，与NF-κB 通路存在交叉。PI3K/Akt 下游靶点为雷帕霉素靶蛋白（mTOR），而mTOR下游转录因子则包括HIF1α、c-Myc 等。抑癌蛋白PTEN 作为磷酸酶可使Akt去磷酸化而减少活化，阻止所有Akt 调控的下游信号传导事件，是PI3K 的负向调控因子。近年大量研究发现PI3K/Akt/mTOR信号通路在肿瘤发生和治疗具有重要作用［16-18］，也有报道其在阿尔茨海默病发生和治疗中有重要作用［19］。本研究通过网络药理学分析推测CS 对AKI的防治作用可能与多条信号通路相关，其中PI3K/Akt/mTOR 信号通路是核心通路，与炎症通路TNF、NF-κB 信号通路、MAPK 信号通路、细胞凋亡通路等均存在交叉相关，在AKI 中的作用及治疗价值尚待进一步研究。

综上，本研究从网络药理学角度发现了CS防治AKI 的主要有效成分和关键靶点，通过对作用靶点的GO 和KEGG 通路富集分析推测CS可能通过调节PI3K-Akt 信号通路等多条信号通路介导细胞凋亡、细胞自噬、铁死亡、炎症反应等病理生理过程，从而发挥对AKI的肾脏保护作用。但本研究单纯从网络药理学角度对现有数据库进行了挖掘，存在一定局限性，为后续进一步研究CS防治AKI的作用机制提供了理论依据。