高效液相色谱-串联质谱法测定两当狼牙蜜中5种苦参类生物碱

◎ 禹 洁， 周 佳， 苏阿龙， 王丽君， 顾培良

（甘肃省食品检验研究院， 甘肃 兰州 730300）

生物碱是广泛存在于自然界中的一类含氮碱性物质，具有一定的毒理作用和药理作用[1-3]。苦参类生物碱广泛存在于苦参、苦豆子等豆科植物当中[4]。苦参碱和氧化苦参碱均属于苦参类生物碱中的活性成分，两者在特定的条件下能够互相转化[5]，具有抗肿瘤、抗炎症、调整心律、保护心脏、提高免疫力等多种功效[6-7]。除此之外，在病虫害预防及治理方面，苦参碱和氧化苦参碱是一类利用率高，效果显著的植物源杀虫剂，具有低毒性、低残留等优点，被广泛被应用在防治各种松毛虫、茶毛虫等农林害虫领域[8-9]。槐果碱即13,14-脱二氢苦参碱，氧化槐果碱即13,14-脱二氢氧化苦参碱，均属苦参类生物碱，有研究发现，其具有调节心律失常和一定的中枢神经药理作用[10]。槐定碱即5β-苦参碱，是苦参碱（α-苦参碱）的差向异构体，研究表明，槐定碱对多种癌症尤其是消化道类癌症疗效很好，且不良反应发生率较低。近年，槐定碱因具有稳定、化学结构灵活、生物利用度高、安全性好等优点，受到学界广泛关注[11-13]。

狼牙刺（Sophora viciifolia Hance）为豆科槐属多年生灌木，又名白刺花，通常生长于海拔1 000～1 500 m的阳坡或河谷地带，广泛分布于我国的陕西、甘肃等地。狼牙刺不同部位中均含有苦参碱、氧化苦参碱等多种生物碱，其中，氧化苦参碱的含量在果实中可高达3.6%[14-17]。此外，狼牙刺还是一种特色蜜源植物，因狼牙刺花而得名的狼牙蜜，产量大，品质独特，内含丰富的矿物质、氨基酸、维生素和活性酶等营养物质，能够被人体吸收，体现了较高的食用和药用价值。狼牙蜜盛产于甘肃两当县、徽县，是在得天独厚的地理环境和优渥的资源条件下，经过长期的自然选择和精炼加工孕育而生的一种特殊产品，年产量达5万多kg，远销中外，两当县也因此被誉为“狼牙蜜之乡”[18-19]。2008年，原国家质量监督检验检疫总局将两当狼牙蜜作为地理标志产品[20]。目前，对狼牙刺植株中生物碱的组成和含量测定已有不少报道[21-23]，蜂蜜中生物碱的测定采用固相萃取、QuEChERS提取和净化，然后用高效液相色谱－串联质谱法进行定性和定量分析[1-2]，但对狼牙蜜中苦参类生物碱的组成及含量测定至今未有报道。

本研究以两当狼牙蜜中苦参类生物碱为研究对象，采用液液萃取结合高效液相-串联质谱建立一种简单、快速、准确的定性定量分析方法，旨在为狼牙蜜中苦参类生物碱的风险评估提供依据，更好地研究与开发与狼牙刺有关的植物资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲醇、三氯甲烷、甲酸：色谱纯（德国默克公司）；乙酸铵：色谱纯（上海安谱实验科技股份有限公司）；氨水：分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。

苦参碱（纯度：98.9%)、氧化苦参碱（纯度：99.1%)、氧化槐果碱（纯度：99.4%)、槐定碱（纯度：98.5%)，均购自上海安谱实验科技股份有限公司；槐果碱（纯度：99.85%)，购于Stanford Chemicals 上海佰世凯化学科技有限公司。

蜂蜜：共65份，根据蜜源进行分类。其中，狼牙蜜10份，槐花蜜10份，枣花蜜10份，油菜蜜10份，椴树蜜5份，枸杞蜜5份，桂花蜜5份，茴香蜜5份，野菊花蜜5份。样品均来源于甘肃省两当县及兰州市农贸市场和大型超市。

1.2 仪器与设备

5500QTRAP高效液相色谱串联质谱仪（美国AB.SCIEX公司）；ME403T电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器公司）；Elmasonic P 300 H超声波清洗机（德国Elma公司）；SORVALL LYNX 6000高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；VORTEX 3涡旋混合器（德国IKA公司）；N-EVAP116氮吹仪（美国Organomation公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

称取搅拌均匀的蜂蜜样品2 g（准确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入3 mL氨水使样品溶解，再加入10 mL三氯甲烷，涡旋振荡3 min，超声提取30 min，8 000 r·min-1离心5 min，用吸管将下层三氯甲烷层转移至新的50 mL离心管中，用10 mL三氯甲烷反复洗涤吸管，洗涤液转移至残渣中经上述相同操作进行提取。重复此过程3次，合并提取液于40 ℃氮气吹干。残留物以初始流动相溶解并定容至1 mL。经0.22 μm微孔滤膜过滤后，待测。

1.3.2 标准溶液配制

（1）混合标准储备液。准确称取适量的5种苦参类生物碱标准物质于100 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成浓度为100 μg·mL-1的标准储备溶液，4 ℃储存备用。

（2）混合标准中间液。准确量取配制的混合标准储备液100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成浓度为1 μg·mL-1的混合标准中间液。

（3）标准系列工作液。临用时，取配制的混合标准中间液适量，用初始流动相稀释制成含5种苦参类生物碱浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的标准系列工作液。

（4）基质标准溶液 。用空白基质蜂蜜样品按1.3.1样品前处理方法制得空白基质溶液，采用空白基质溶液配制成0.1、0.2、0.5、1.0 、2.0、5.0、10.0 、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的基质匹配标准工作液。

1.3.3 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters ACQUITY UPLC®BEH C18色谱柱（50×2.1 mm，1.7 μm）；色谱柱温度：30 ℃；进样量：10.0 μL；流动相：A为2 mmol乙酸铵-0.1%甲酸水溶液，B为2 mmol乙酸铵-0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.25 mL·min-1；梯度洗脱程序：0～1.0 min，95% A；1.0～4.0 min，95%～10% A；4.0～6.0 min，10% A；6.0～6.1 min，10%～95% A；6.1～8.0 min，95% A。

（2）质谱条件。电喷雾离子源（Electron Spray Ionization， ESI)，正离子模式扫描；离子化电压（IonSpray Voltage， IS）：+5 500 V；动态多反应监测（Multiple Reaction Monitoring， MRM）模式，5种苦参类生物碱的质谱参数详见表1。

表1 5种苦参类生物碱的质谱参数表

1.4 数据处理

将实验获取的数据在MultiQuant软件进行处理分析，以5种苦参类生物碱的保留时间、定性离子、定量离子及两个子离子的相对丰度比进行定性判断；绘制基质标准曲线定量分析蜂蜜样品中的不同目标物；采用Origin 2022软件进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 质谱条件

在正离子模式下，找出加合离子峰，在一定的去簇电压和碰撞能量下，选择子离子中相对丰度较强的2对子离子作为定性和定量离子对。在去簇电压不断增大的变化过程中，簇离子会随之减少，目标加合离子的响应强度增高，当电压增大到一定数值时，由于源内裂解的发生，导致目标加合离子的响应随之降低，从而优化出最佳去簇电压。当碰撞能量不断增大过程中，目标加合离子响应会降低，特征子离子响应增强，当达到一定数值时，特征子离子会进一步碎裂，从而响应减弱，此过程可优化出最佳碰撞能量（见表1）。

2.1.2 色谱条件

本研究比较了乙腈-0.1%甲酸水；0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸铵；（2 mmol乙酸铵+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸铵+0.1%甲酸乙腈溶液）作为流动相时5种苦参类生物碱的保留时间及峰形。结果表明，乙腈-0.1%甲酸水体系下目标物分离效果不佳且拖尾现象严重；0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸铵体系下，因为乙酸铵的加入使5种苦参类生物碱的分离效果得到改善，但是出峰时间较早，可能存在目标物未完全洗脱的情况。（2 mmol乙酸铵+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸铵+0.1%甲酸乙腈溶液）作为流动相时，5种苦参类生物碱出峰时间适宜，目标物响应强度增加，峰形尖锐，分离效果较好，可能是由于加入缓冲盐后，可以降低碱基与色谱柱中极性的硅醇基相互作用，从而改善因其导致的拖尾效应[24]。因此，采用（2 mmol乙酸铵+0.1%甲酸水溶液）-（2 mmol乙酸铵+0.1%甲酸乙腈溶液）作为流动相进行梯度洗脱，在8 min内完成目标物的测定（如图1、2）。

图1 5种苦参类生物碱标准溶液的MRM色谱图

2.2 提取条件的优化

2.2.1 提取溶剂的选择

在萃取过程中，本研究比较了甲醇、乙腈、正己烷和三氯甲烷作为提取剂的提取效果。其中，正己烷对极性化合物的提取效果较差；甲醇作为提取剂，会出现微量沉淀物，提取效率低；乙腈和三氯甲烷都能使目标物富集，提取效果较好，但在最后的浓缩过程中三氯甲烷更易挥发，能更快氮吹干，进而缩短前处理时间，提高前处理的效率（如表2）。此外，本研究进行了多次重复提取，可以使目标物提取充分，降低损失，提高回收率。

2.2.2 料液比的优化

蜂蜜中含糖量较高，一般在60%～80%，若直接提取可能由于蜂蜜本身黏度较大，目标物附着于糖分上，影响提取效果[25]。因此，先用适量水溶解狼牙蜜，使其成为均匀相，再进行后续提取步骤。直接用三氯甲烷萃取，提取效果较好。为了更进一步提高回收率，使用适量氨水溶解狼牙蜜，同时，因苦参类生物碱为碱性化合物，遂在萃取溶剂中加入适量碱，以增加其在三氯甲烷中的溶解度。

此外，本研究考察了狼牙蜜质量同氨水添加量的不同配比，随着氨水添加量的增加，回收率也相应提高，由图3可知，当狼牙蜜质量与氨水比例为1∶1.5时，提取效果最佳，回收率最高；当狼牙蜜质量与氨水比例为1∶2时，回收率略微下降，继续增大氨水比例，回收率继续降低。故选择称取2.00 g狼牙蜜，加入3 mL氨水进行溶解。

图3 料液比对回收率的影响图（n=3）

2.3 基质效应考察

基质效应是指对复杂目标物进行分析时，除了被分析物外，其他存在的物质对整个分析过程造成的影响。基质效应可以在很大程度上导致目标物信号的增强或抑制，从而影响定性和定量分析。干扰物质可以是样品的组分、预处理萃取过程中释放的化合物，或添加到流动相中以提高色谱分辨率的试剂等。总之，目标分析物的化学性质、基质的种类、基质与分析物的浓度比、提取工艺、色谱条件以及质谱仪器的种类和电离条件，都可以引起基质效应[26]。在高效液相-串联质谱分析中，基质效应的考察显得非常重要。基质效应采用标准曲线法，即基质效应是基质标准系列浓度曲线的斜率/溶剂标准系列浓度曲线的斜率进行评估[27]。基质效应小于100%，表明存在基质抑制；基质效应大于100%，表明存在基质增强。

本实验选用空白蜂蜜样品，按照1.3.1的前处理方法制得空白基质溶液，配制基质标准工作曲线。同时，用初始流动相配制溶液工作标准曲线，得到两者斜率比，考察基质效应。结果显示，5种苦参类生物碱均存在基质抑制效应。因此，本实验配制基质标准曲线进行了分析定量，数据见表3。

表3 5种苦参类生物碱基质效应表

2.4 方法学验证

2.4.1 方法线性范围及检出限

参照2.1优化后的仪器条件，对5种苦参类生物碱混合标准工作液进行测定，绘制以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标的标准曲线。5种苦参类生物碱在0.1～50 ng·mL-1浓度范围线性关系良好，相关系数R2≥0.999 1。以标准溶液中目标组分最低水平的3倍信噪比为检出限（LOD），10倍信噪比为定量限（LOQ），计算得到本方法的检出限和定量限（见表4）。当称样量为2.00 g时，检出限为0.10～0.20 μg·kg-1；定量限为0.30～0.45 μg·kg-1。

表4 5种苦参类生物碱的线性方程、相关系数、检出限与定量限表

2.4.2 回收率和精密度

为了确证该方法的可行性，本实验对狼牙蜜样品进行加标回收实验，同一批次狼牙蜜中添加3个含量水平的标准溶液，分别为0.5、5 μg·kg-1和20 μg·kg-1，按照1.3.1所述方法进行前处理后上机分析。由表5可知，5种苦参类生物碱的平均回收率在87.82%～93.18%之间，RSD≤3.8%。该结果表明，本实验建立的检测方法在不同浓度加标水平下，能够体现较高的回收率和较好的精密度，能够满足狼牙蜜样品中5种苦参类生物碱的检测要求。

表5 5种苦参类生物碱在不同加标水平下的回收率和相对标准偏差表(%,n=6)

2.5 实际样品测定

本实验采用前处理方法和液相色谱-串联质谱条件，对甘肃省两当县及兰州市农贸市场和大型超市的65份蜂蜜进行了5种苦参类生物碱的分离提取及测定（图4），各目标物含量如表6所示。实际样品分析结果表明，5种苦参类生物碱普遍存在于不同蜜源的蜂蜜中，只有10批次油菜花蜜中未检出苦参碱和槐定碱；10批次枣花蜜和5批次野菊花蜜中未检出槐定碱。狼牙蜜中5种苦参类生物碱的含量均高于其他蜜源品种的蜂蜜，在10批次狼牙蜜中苦参碱最高含量达0.769 μg·kg-1，氧化苦参碱达到2.102 μg·kg-1，槐果碱达到2.332 μg·kg-1，氧化槐果碱为5.987 μg·kg-1，槐定碱为0.882 μg·kg-1。由于狼牙刺的不同器官中均含有苦参类生物碱，其作为一种特色蜜源植物，因而狼牙蜜中也普遍含有苦参类生物碱。

图4 样品中5种苦参类生物碱的MRM色谱图

3 结论与讨论

本研究建立了液液萃取结合高效液相色谱-串联质谱同时测定狼牙蜜中5种苦参类生物碱的检测方法，在碱性条件下液液萃取对目标物进行提取富集，同时，优化色谱条件和质谱条件，采用基质外标法加以定量。实验表明，5种苦参类生物碱在0.1～50 ng·mL-1浓度范围线性关系良好（R2＞0.999 1），方法检出限的范围在0.1～0.2 μg·kg-1之间；定量限范围在0.30 ～0.45 μg·kg-1之间。在不同的加标水平下，5种苦参类生物碱的平均回收率在87.82%～93.18%之间，RSD≤3.8%。由此可见，该方法提取率高，定量准确，适用于狼牙蜜中5种苦参类生物碱的检测。同时，测定的不同蜜源品种蜂蜜中5种苦参类生物碱的含量差异较大，狼牙蜜中5种苦参类生物碱的含量均高于其他品种。

综上所述，本研究重点关注两当狼牙蜜中苦参类生物碱的含量测定，建立了一种高效、准确的检测方法，旨在为狼牙蜜中苦参类生物碱的风险评估提供参考，为学界全面了解狼牙蜜的食用和药用价值提供研究途径和技术支撑。