微小RNA-21 对脓毒症小鼠急性肺损伤的改善作用及其机制

葛晨，何聪，刘俊行，付优，贾丽静，龙玲，杜全胜

1 河北省人民医院重症医学科，石家庄 050000；2 河北省儿童医院骨科

脓毒症患者急性肺损伤 （acute lung injury，ALI）的发生率可达40%，病死率高达40%～50%。高发病率和病死率使脓毒症ALI成为世界范围内亟待解决的医学难题，是导致重症患者死亡的主要原因之一［1］。脓毒症发生发展过程中炎症因子释放及氧化应激会损伤机体细胞、组织和器官，同时炎症反应和氧化应激相互影响、促进，形成炎症—氧化应激的恶性循环，最终导致患者的器官功能障碍和衰竭［2］。近年研究［3］表明，微小RNA（miRNA）在炎症反应、免疫应答等过程中不可或缺，参与调控脓毒症、肿瘤、心血管等疾病的发生发展。最新研究［4］发现，微小RNA-21（miR-21）可抑制血清促炎因子的释放，同时过表达的miR-21 可通过磷脂酶和张力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3 激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（PTEN/PI3K/Akt）信号通路拮抗肾脏细胞的凋亡，减轻脓毒症肾损伤程度。另有研究［5］表明，miR-21-5p 可通过调控PTEN 通路，抑制肺泡上皮细胞的凋亡。本课题组前期研究［6］表明，miR-21 可能通过抑制PTEN，减轻脓毒症小鼠的炎症反应和氧化应激，进而减轻肺损伤。PTEN 是一种双蛋白脂质磷酸酶，可双向调节PI3K/Akt 信号通路［7］。而miR-21是否通过调控PTEN 信号通路，调控下游PI3K/Akt信号通路，从而减轻脓毒症肺损伤的炎症反应及氧化应激水平目前相关研究较少。为此，2022 年3—9月，我们观察了miR-21 对脓毒症小鼠ALI 的改善作用及肺组织PTEN、Akt 的调控作用，进一步探讨miR-21 在脓毒症ALI 发生发展中的具体分子机制，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 健康雄性昆明小鼠40 只，体质量25～35 g，购于河北医科大学实验动物中心，购买后饲养于清洁级动物房，温度20 ℃左右，湿度40%～60%，自然光照，自由进食、饮水。小鼠肿瘤坏死因子α （TNF-α）、白细胞介素6 （IL-6）ELISA 试剂盒购于杭州联科科技公司，小鼠活性氧簇（ROS）、超氧化物歧化酶 （SOD） ELISA 试剂盒购自南京建成生物工程研究所；miR-21 前体腺病毒载体购于美国invitrogen 公司，实时荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒购自美国Gene Copoeia 公司，RT-PCR 引物由广州复能公司设计合成；PI3K/Akt抑制剂LY294002 购于美国MCE 公司，PTEN 抗体和二抗购于美国KPL 公司，磷酸化Akt（p-Akt）抗体和二抗购于美国CST公司。

1.2 小鼠分组及miR-21、LY294002 给予方法 取40 只小鼠，按照随机数字表法分为miR-21 前体 +ALI 组 （Pre-miR-21 + ALI 组）、miR-21 前体+ LY294002 + ALI 组（Pre-miR-21 + LY + ALI组）、LY294002 + ALI组 （LY + ALI组）、ALI组、假手术组。ALI 组小鼠采用盲肠结扎穿孔术（CLP）造成脓毒症ALI：术前禁食12 h，予10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉小鼠，固定、备皮、消毒，沿腹正中线行约1 cm切口，分离盲肠，用18号无菌针头贯穿盲肠，轻微挤压致少许肠内容物流出，将盲肠还纳腹腔后缝合腹壁切口。Pre-miR-21 + ALI 组小鼠先尾静脉注射miR-21前体腺病毒0.2 mL，4天后采用CLP造成脓毒症ALI；Pre-miR-21 + LY + ALI 组小鼠先尾静脉注射miR-21前体腺病毒0.2 mL，4天后尾静脉注射LY（0.3 mg/g），注射30 min 后进行CLP；LY + ALI组小鼠先尾静脉注射LY（0.3 mg/g），注射30 min 后进行CLP；假手术组小鼠仅开腹探查盲肠。

1.3 各组小鼠肺损伤程度观察

1.3.1 各组小鼠氧合指数 （OI） 及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD 检测 盲肠结扎穿孔术后第24 h时，取各组小鼠，麻醉后开腹取腹主动脉血3 mL，其中1 mL 进行血气分析，以氧分压/吸入氧浓度测算OI；另2 mL 低温离心后取血清，严格按照ELISA 试剂盒说明书检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD。实验重复测算3次，取平均值。

1.3.2 各组小鼠右肺组织W/D检测 “1.3”取腹主动脉血后处死各组小鼠，取右肺上叶，置于4%多聚甲醛中固定，进行石蜡包埋、常规切片，hematoxylin-eosin， HE染色后显微镜下观察各组小鼠肺组织病理学变化。另取各组小鼠右肺下叶，吸水纸吸净后称重，记录为肺湿重；再置于70 ℃恒温箱48 h后复测，记录为肺干重，测定肺湿重、干重比值为肺组织W/D。

1.4 各组小鼠左肺组织miR-21 检测 采用RTPCR 法。 取各组小鼠左肺组织，按照RT-PCR 试剂盒说明书提取肺组织RNA，按照miRNA 逆转录试剂盒进行逆转录，以U6 为内参，以2-ΔΔCt代表miR-21 的相对表达量。所有操作均严格按照试剂盒说明书进行，实验重复测算3次，取平均值。

1.5 各组小鼠左肺组织PTEN、p-Akt蛋白检测 采用WESTERN Blotting 法。取各组小鼠左肺组织，BCA 法进行蛋白定量，电泳、转膜、封闭，分别加入PTEN、p-Akt 一抗、二抗孵育、洗膜，化学发光法显色，采用Image J 软件测定目的蛋白的条带灰度值，以目的蛋白的条带灰度值与内参GAPDH 灰度值比值作为目的蛋白的相对表达量。实验重复测算3次，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件进行数据处理。通过Shapiro-Wilk 检验数据的正态性，符合正态分布的计量资料以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠OI 及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD 水平比较 各组小鼠OI及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比较见表1。

表1 各组小鼠OI及血清TNF-α、IL-6、ROS、SOD水平比较（-x ± s）

2.2 各组小鼠右肺组织病理学变化及W/D 比较假手术组小鼠肺泡结构清晰，肺泡腔内无出血渗出；ALI 组肺泡结构损伤，肺泡腔内可见红细胞，肺泡间隔增宽，炎性细胞浸润；Pre-miR-21 + ALI 组肺泡损伤程度、肺泡间隔厚度改善，炎性细胞浸润减少；Pre-miR-21 + LY + ALI组、LY + ALI组肺泡损伤程度加重，肺泡间隔增厚，炎性细胞浸润增多，其中LY +ALI 组肺泡损伤程度最重，肺泡间隔增厚、炎性细胞浸润最明显。Pre-miR-21 + LY + ALI 组、Pre-miR-21+ ALI组、LY + ALI组、ALI组及假手术组小鼠右肺组织W/D 分别为9.7 ± 1.0、6.1 ± 0.5、12.1 ± 0.9、7.3 ± 0.7、4.0 ± 0.4。与假手术组比较，ALI 组小鼠右肺组织W/D高 （P＜0.05）；与ALI组比较，Pre-miR-21 + ALI 组小鼠右肺组织W/D 低 （P＜0.05），Pre-miR-21 + LY + ALI组、LY + ALI组小鼠右肺组织W/D高 （P均＜0.05）；与Pre-miR-21 + LY + ALI组比较，LY + ALI组小鼠右肺组织W/D高 （P＜0.05）。

2.3 各组小鼠左肺组织miR-21 相对表达量比较Pre-miR-21 + LY + ALI 组、Pre-miR-21 + ALI 组、LY+ ALI组、ALI组及假手术组小鼠左肺组织miR-21相对表达量分别为5.19 ± 0.35、4.29 ± 0.45、2.70 ±0.25、2.26 ± 0.24 及0.96 ± 0.08。与假手术组比较，ALI 组小鼠左肺组织miR-21 相对表达量高 （P＜0.05）；与ALI 组比较，Pre-miR-21 + LY + ALI 组、Pre-miR-21 + ALI 组小鼠左肺组织miR-21 相对表达量高（P均＜0.05）；与Pre-miR-21 + LY + ALI 组比较，LY + ALI 组小鼠左肺组织miR-21 相对表达量低（P＜0.05）。

2.4 各组小鼠左肺组织PTEN、p-Akt蛋白相对表达量比较 各组小鼠左肺组织PTEN、p-Akt 蛋白相对表达量比较见表2。

表2 各组小鼠左肺组织PTEN、p-Akt蛋白相对表达量比较（-x ± s）

3 讨论

ALI是脓毒症的常见并发症，其特征是过度炎症反应及氧化应激导致细胞凋亡、肺水肿和肺组织功能障碍［8］。首先，脓毒症会导致大量炎症因子释放，其中TNF-α是较早出现的炎症因子，其能导致炎症瀑布级联反应，激活炎症细胞促使IL-6等其他炎症因子大量释放入血，加重炎症反应，同时这些炎症因子能损伤肺泡上皮细胞和肺毛细血管细胞，使肺泡水肿或塌陷，引起肺损伤，导致低氧血症。其次，炎症因子还会导致大量活性氧合成和分泌，对稳定细胞器和生物膜的蛋白质和脂类产生强氧化作用，使肺组织细胞过度氧化，导致肺组织缺血、水肿，加重肺损伤。

miRNA 能够与靶基因3’非翻译区结合抑制靶基因翻译，从而调节蛋白表达，广泛参与炎症反应、免疫应答等过程［9］。有研究［4］证实，miR-21 可抑制促炎因子释放，且miR-21 过表达可通过PTEN/PI3K/Akt 信号通路拮抗肾脏细胞凋亡减轻脓毒症肾损伤。也有研究［5］指出，miR-21-5p 过表达可通过PTEN 显著减少肺泡上皮细胞凋亡。研究发现，加用miR-21模拟物后肺组织miR-21表达增加，通过外源性加入miR-21 模拟物可使肺组织miR-21 表达上调，且上调miR-21 表达可减轻脓毒症小鼠炎症反应和氧化应激反应，进而减轻炎症因子和氧化应激对肺泡上皮细胞和肺毛细血管细胞的损伤，减轻肺损伤，改善低氧血症。提示miRNA-21 可能通过与炎症通路相互作用抑制炎症反应、减轻氧化应激反应，从而改善肺损伤。

miR-21 通过负向调节PTEN 进而影响细胞分化、生长、增殖、凋亡进而对各类炎症性疾病发挥调控作用［4］。PTEN 是miR-21 的靶基因，miR-21 可通过抑制PTEN 促进肿瘤细胞凋亡［10］。在脓毒症相关肾损伤中，miR-21 也被证实可通过调控PTEN 减少肾脏细胞凋亡从而减轻肾损伤［4］。PTEN 作为一种双重特异性磷酸酶，可以双向调节PI3K/Akt信号通路［7］。PI3K/Akt 信号通路在调节炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等过程中起到重要作用［11］。激活PI3K/Akt信号通路，使Akt蛋白磷酸化，可抑制炎症反应，减少炎症因子产生，减轻脓毒症所致的肾损伤及心肌损伤［12］。有研究［13］指出激活PI3K/Akt 信号通路可有效减轻高氧所致的细胞凋亡和氧化应激从而减轻肺损伤。本研究结果发现miR-21 过表达可抑制 PTEN 蛋白表达，p-Akt蛋白表达增加，促进Akt磷酸化，提示miR-21 可能通过抑制PTEN 导致Akt磷酸化发挥抗炎、抗氧化作用。抑制PI3K/Akt通路可加重ALI，而miR-21过表达对ALI中炎症反应及氧化应激反应的减轻可能与PI3K/Akt 信号通路有关。miR-21预处理后肺组织PTEN蛋白表达下降，p-Akt 蛋白表达增加，促进Akt 磷酸化，而PI3K/Akt 通路抑制剂处理后，p-Akt蛋白表达降低，抑制Akt磷酸化，说明miR-21 在小鼠脓毒症ALI 中可通过调控PTEN激活PI3K/Akt信号通路。

综上所述，上调miR-21 表达的脓毒症小鼠肺组织炎症反应和氧化应激反应水平低。miR-21 可能通过负向调控PTEN 激活PI3K/Akt通路减轻脓毒症炎症反应和氧化应激，从而减轻小鼠脓毒症ALI。