恩格列净灌胃对高血压大鼠心室舒张功能障碍的改善作用及其机制

姚卫杰，于翔

1 天津医科大学朱宪彝纪念医院心内科，天津 300134；2 天津市内分泌研究所；3 国家卫健委激素与发育重点实验室；4 天津市代谢性疾病重点实验室

流行病学研究［1］显示，射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）是65 岁以上人群中最常见的心衰形式，老年妇女中大于80%的新发心衰类型为HFpEF。高血压是HFpEF 的常见致病因素。60%～89%的高血压患者可发生HFpEF［2］，表现为运动后的血压过度升高和高血压性肺水肿［3］。降压治疗可有效改善HFpEF 患者的预后。临床应用过程中发现，ACEI/ARB、β 受体阻滞剂的应用并没改善HFpEF 患者的预后或降低病死率［4］。最新研究［5］发现，高血压合并HFpEF 患者可同时存在肌联蛋白磷酸化依赖性和胶原依赖性的心肌僵硬度增加，提示心室舒张功能障碍是其重要的病理生理改变，因此，恢复高血压患者心室舒张功能可能有助于改善其心脏临床结局。恩格列净是一种钠葡萄糖共转运体2 抑制剂（SGLT2i）。一项恩格列净的心血管结局试验［6］发现，恩格列净可降低糖尿病患者的心血管死亡率、全因死亡率和心力衰竭住院率。新近发表的EMPEROR-Preserved 研究［9］已证实，恩格列净可降低HFpEF 患者心血管死亡和因心衰住院风险。恩格列净可以改善糖尿病患者的心肌氧化应激和间质纤维化水平，改善心室舒张功能［8］。另有研究［9］提示，恩格列净可以通过改善心肌细胞肌丝磷酸化水平，降低心肌细胞僵硬度，改善心肌舒张功能。恩格列净是否可以改善高血压大鼠的心室舒张功能障碍，目前尚无相关研究。为此，我们观察了恩格列净灌胃对高血压大鼠心室舒张功能障碍的改善作用，并进一步探讨其可能作用机制。现报告如下

1 资料与方法

1.1 大鼠分组、高血压心室舒张功能障碍模型制备及恩格列净给予方法 8周龄雄性SD 大鼠25只（购自北京华阜康公司），体质量200～220 g。所有动物实验均经天津医科大学朱宪彝纪念医院动物伦理委员会批准。

1.1.1 高血压心室舒张功能障碍模型制备 25 只大鼠中20 只（模型组）参照文献［10］行腹主动脉缩窄术（abdominal aortic coarctation，AAC）构建高血压致压力超负荷心室重构模型：以2.5%戊巴比妥钠2 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠，在无菌环境下于剑突下2～3 cm，腹正中切口切开皮肤，暴露腹腔，将腹部脏器一并推向右侧，在右肾动脉上方1.5 cm 处用两只弯镊剥离并充分暴露腹主动脉，取出置于生理盐水的7 号针头，将针头与大鼠腹主动脉平行放置，再用4-0手术线一并结扎，随后抽出7号针头，剪去过长的手术缝线，手术后所有大鼠腹腔注射5 000 U 青霉素防止感染，关闭腹腔。另外5 只大鼠在手术时仅将腹主动脉分离后关闭腹腔（假手术组）。模型组大鼠术后死亡4只、超声检测时因麻醉过深死亡1 只。术后第8 周，检测大鼠血压，对大鼠行超声心动图检查，评估大鼠心室收缩及舒张功能。相较于假手术组，模型组大鼠血压明显升高，E峰减速时间（EDT）明显延长，E/A 值明显下降，左心室质量明显增加，舒张期左室前壁厚度（LVAWd）明显增厚，LVIDs 明显增大，舒张期左室后壁厚度（LVPWd）明显增厚（P均＜0.05），最终15 只大鼠建模成功。

1.1.2 大鼠分组及恩格列净给予方法 15 只模型大鼠随机分为A、B、C 三组（每组各5 只），即刻实施超声心动图检查（给药前），观察并记录大鼠心室结构参数、心室舒张功能参数、心室收缩功能参数。A组大鼠检查后予恩格列净10 mg/（kg·d）灌胃，1 次/天，连续灌胃4 周（给药后）；B 组大鼠第同时间予生理盐水灌胃，1 次/天，连续灌胃4 周；C 组大鼠于给药前脱颈处死留取心肌组织备用。

1.2 各组大鼠心室结构、心室舒张功能及心室收缩功能检查 采用超声心动图检查。超声图像采集及测量均有专业医师操作，各项心脏结构及心功能指标测量5 个心动周期，计算平均值。大鼠吸入异氟烷麻醉后，使用小动物超声系统（Visual Sonics Vevo 2100） 进行超声心动图检查。检测内容包括心脏结构参数：室前壁厚度（LVAW）、左室后壁厚度（LVPW）、左室舒张末期内径（LVIDd）和LVIDs；舒张功能参数：左室等容舒张时间（IVRT）、EEDT、舒张早期最大峰值速度（E）及舒张晚期最大峰值速度（A），测算E/A；收缩功能参数：根据LVDd 及LVDs计算LVEF和左室短轴缩短率（LVFS）评价大鼠的收缩功能。各指标均重复测算3次，取平均值。

1.3 各组大鼠心肌组织氧化应激指标、炎症指标及间质纤维化指标检测 A、B组大鼠给药后再次行超声心动图检查，检查后脱颈处死取心肌组织。取三组大鼠心肌组织，分离冲洗心室组织，离心制成心肌匀浆，采用商业ELISA 试剂盒分别检测丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β。另取部分心肌组织，采用WESTERN Blotting 法检测心肌细胞NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3），分别用非标记大鼠NLRP3单克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。β 微管蛋白作为内参，用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，以蛋白条带灰度值代表目的蛋白的相对表达量。实验重复测算3次，取平均值。

1.4 统计学方法 采用SPSS24统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏结构参数、心室舒张功能参数、心室收缩功能参数比较 给药前各组大鼠心脏结构参数见表1，给药前各组大鼠心室舒张功能参数、心室收缩功能参数见表2。由表1、2可见，给药前各组大鼠心脏结构参数、心室舒张功能参数、心室收缩功能参数间差异均无统计学意义。

表1 给药前各组大鼠心脏结构参数（mm，±s）

表1 给药前各组大鼠心脏结构参数（mm，±s）

组别A组B组C组LVAWd 2.80 ± 0.73 2.21 ± 0.29 2.51 ± 0.54 LVPWs 4.07 ± 0.27 3.77 ± 0.51 3.91 ± 0.54 LVAWs 4.32 ± 0.90 3.37 ± 0.26 3.91 ± 0.64 LVIDd 7.27 ± 0.94 7.66 ± 0.25 7.31 ± 1.08 LVIDs 3.78 ± 1.20 4.52 ± 0.54 4.27 ± 0.97 LVPWd 2.87 ± 0.39 2.73 ± 0.38 2.76 ± 0.40

表2 给药前各组大鼠心室舒张功能参数、心室收缩功能参数（±s）

表2 给药前各组大鼠心室舒张功能参数、心室收缩功能参数（±s）

组别A组B组C组IVRT（ms）23.88 ± 3.59 22.82 ± 4.17 19.19 ± 2.32 EDT 39.05 ± 4.12 38.10 ± 5.17 40.75 ± 4.64 E/A 1.00 ± 0.09 1.04 ± 0.11 1.04 ± 0.19 LVEF（%）76.14 ± 9.62 70.05 ± 6.23 71.9 ± 7.84 LVFS（%）47.47 ± 10.43 41.37 ± 5.42 42.79 ± 6.65 LVM（%）1 506.82 ± 165.72 1 368.30 ± 84.46 1 375.63 ± 286.44

给药后A、B 组大鼠心脏结构参数见表3，给药后A、B 组大鼠心室舒张功能参数、心室收缩功能参数见表4。 与B 组比较，给药后A 组大鼠IVRT短、LVM 及LVIDs 下降（P均＜0.05）。与给药前比较，给药后A 组大鼠IVRT 短、LVM 及LVIDs 下降（P均＜0.05）。

表3 给药后各组大鼠心脏结构参数（mm，±s）

表3 给药后各组大鼠心脏结构参数（mm，±s）

组别A组B组LVAWd 2.43 ± 0.36 2.47 ± 0.19 LVPWs 3.72 ± 0.35 3.97 ± 0.38 LVAWs 4.04 ± 0.24 3.64 ± 0.14 LVIDd 7.38 ± 0.0.71 7.97 ± 0.46 LVIDs 3.76 ± 0.69 4.74 ± 0.41 LVPWd 2.67 ± 0.38 2.90 ± 0.57

表4 给药后两组大鼠心室舒张功能参数、心室收缩功能参数（±s）

表4 给药后两组大鼠心室舒张功能参数、心室收缩功能参数（±s）

组别A组B组IVRT（ms）16.76 ± 2.83 25.91 ± 1.90 EDT 33.98 ± 4.12 43.28 ± 4.00 E/A 1.16 ± 0.20 1.03 ± 0.15 LVEF（%）76.93 ± 5.02 70.01 ± 6.25 LVFS（%）47.73 ± 4.84 41.59 ± 5.38 LVM（%）1 287.48 ± 111.02 1 455.39 ± 54.79

2.2 两组大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β 含量及NLRP3 相对表达量比较 给药后两组大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β 含量及NLRP3 相对表达量见表5。与B 组比较，给药后A 组大鼠心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、MDA、TGF-β 含量低，SOD、GSH-PX 含量高，NLRP3 相对表达量低（P均＜0.05）。

表5 给药后两组大鼠心肌组织MDA、SOD、GSH-PX、I型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β含量及NLRP3相对表达量（±s）

组别A组B组MDA 2.14 ± 0.05 2.40 ± 0.18 SOD 132.89 ± 10.15 103.23 ± 3.58 GSH-PX 25.24 ± 0.80 19.68 ± 1.73Ⅰ型胶原20 973.38 ± 6 529.96 54 135.42 ± 7 024.49Ⅲ型胶原32.05 ± 4.52 88.56 ± 13.17 TGF-β 355.85 ± 25.13 629.31 ± 153.37

3 讨论

长期高血压引起以心肌纤维化及心肌细胞肥大为特征的心脏重塑，促使心肌僵硬度增加，进而增加心力衰竭或猝死的发生风险［11］。因此，高血压患者心脏保护应以改善高血压心肌重塑为重点。既往高血压性心肌病的治疗主要依赖于良好的血压控制及神经激素抑制剂的应用。ACEI/ARB 类降压药物已被证实可通过阻断RAAS 系统介导的心室重塑更好的改善患者预后［12］。但既往临床研究［4］中发现，ACEI/ARB、β 受体阻滞剂的应用并没改善HFpEF患者的预后或降低病死率。

炎症反应在高血压的发生和进展中不可或缺，表现为炎症细胞的转运、积累和激活，以及激活的先天免疫细胞和内皮细胞产生促炎细胞因子和自由基，并与高血压并发症如心肌梗死、出血性中风和肾损伤有关［13］。有学者［14］发现NLRP3炎症小体及其下游的炎症因子在心力衰竭的动物模型中表达升高，并参与心室重塑的病理过程。因此，除经典的神经体液机制和交感神经系统机制外，炎症反应在心室重塑中也起着重要的作用［15］。同时，高血压导致线粒体功能障碍、增强活性氧/RNS 的产生，促进了心肌组织损伤和亚临床炎症状态的维持［16］。研究［17］表明，高血压导致的心脏重塑可引起活性氧形成增加，通过影响硫氧还蛋白相互作用蛋白与硫氧还蛋白之间的失衡，诱导NLRP3 表达上调。NLRP3 炎性小体参与炎性细胞释放下游炎症因子如IL-1β、IL-18，从而促进更多炎症因子如TGF-α、IL-6、TGF-β等的释放［18］。而TGF-β通过诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，在组织纤维化的发展中起着核心作用［19］。心脏成纤维细胞产生的胶原纤维在细胞间过度积累，导致心脏顺应性降低，舒张功能障碍。因此，这种慢性的炎症状态和氧化应激有参与了高血压性心肌重塑过程，并导致心力衰竭的发生、发展［20］。本研究同样发现，在模型组心肌氧化应激标志物、炎症因子、NLRP3、TGF-β 水平明显升高，Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维沉积增多，与既往研究相符。这些病理变化与高血压心肌肥厚、舒张功能障碍变化相一致。因此阻断心肌氧化应激、炎症反应通路，有可能逆转高血压性心室重塑，改善高血压患者远期心脏预后。

恩格列净是一种SGLT2 抑制剂，主要用于改善糖尿病患者的血糖管理，但其用于非糖尿病患者并不增加低血糖风险［7］。研究［21］显示，SGLT-2 抑制剂可以通过抑制活性氧/NLRP3/半胱氨酸蛋白酶 1（Caspase-1）信号通路来抑制动脉粥样硬化的炎症反应。SGLT-2抑制剂还可以抑制 NLRP3/凋亡相关微粒蛋白（ASC）通路激活，减轻2 型糖尿病小鼠糖尿病性心肌病的发展［22］。2023ESC 对于2021 版《急性和慢性心力衰竭诊断和治疗指南》更新建议中，将恩格列净推荐用于全射血分数保留型心衰的治疗，特别是指南首次将恩格列净推荐用于射血分数轻度减低型心衰（HFmrEF）和HFpEF 心衰的治疗［23］。本研究发现，模型组左心室质量明显增加、EDT明显延长、E/A 明显下降。在药物干预后，与对照组相比，恩格列净组大鼠心脏IVRT明显缩短、左心室质量明显下降，提示恩格列净可以改善心肌重塑及左室舒张功能。同时，与对照组相比，恩格列净组氧化应激、TGF-β、NLRP3炎症小体及心肌纤维化水平明显下降。提示恩格列净可以通过改善氧化应激，阻断炎症级联反应过程，逆转心肌纤维化，改善高血压大鼠心肌重塑及心室舒张功能。这可能是恩格列净改善非射血分数减低型心衰患者心衰再入院及心血管死亡结局的潜在病理机制。关于恩格列净改善炎症反应及氧化应激的机制，可能来源于以下途径：①阻断NHE：一些炎症因子可以激活细胞NHE（Na/H exchanger）交换体，增加细胞内钠离子水平，而细胞内钠离子水平的增加会增加活性氧的产生。恩格列净通过阻断NHE，从而减低炎症反应和氧化应激［24］。②激活AMPK 通路： AMPK 细胞通路是调节细胞生长、能量代谢、自噬的关键通路，激活AMPK通路可以有效抑制细胞炎症、氧化应激。恩格列净可提高细胞内AMPK 蛋白表达水平，改善细胞能量代谢、降低炎症因子水平［25］。

综上所述，恩格列净灌胃可减轻高血压大鼠心室舒张功能障碍，降低心肌组织中氧化应激、炎症因子、纤维蛋白含量，其机制可能与恩格列净抑制心肌组织氧化应激、炎症因子、组织间纤维蛋白含量有关。