肺腺癌组织中赖氨酸乙酰转移酶5、鼠双微体2表达观察

黄景涛，孙龙飞，郑竞雄，米良，梁宗英

承德医学院附属医院胸外科，河北承德 067000

肺癌是全球范围内死亡率最高的恶性肿瘤［1］。肺腺癌是肺癌的重要病理类型之一，其发病率和病死率呈逐年上升趋势，且预后差［2］。组蛋白乙酰化修饰是基因转录的重要调控方式，该调节影响核小体的动态过程，异常调控的乙酰化和癌症的发展有关。赖氨酸乙酰转移酶5［K（lysine） acetyltransferase，KAT5］属于组蛋白乙酰化酶MYST家族，通过调节底物的稳定性及活性参与组蛋白的乙酰化修饰，参与多种肿瘤的发生发展［3］。癌组织中高表达的KAT5 可进一步促进c-myc 表达，发挥促癌作用［4］。鼠双微体2 （murine double minute 2， MDM2）是一个能促进细胞生长转化的癌基因，可以与P53结合，调节MDM2-P53 负反馈环，调节细胞的增殖凋亡相关信号通路［5］。最新研究［6］发现，KAT5 存在与MDM2特异性结合的泛素化结合位点，KAT5 受泛素—蛋白酶体途径的调节，MDM2 可以蛋白酶体依赖的方式诱导KAT5 的降解。目前探讨KAT5、MDM2 在肺腺癌发生发展中的作用相关研究较少，鉴于既往研究中KAT5、MDM2 的肿瘤促进作用。2022 年10 月—2023 年5 月，我们观察了肺腺癌组织中KAT5、MDM2的表达变化，探讨其临床意义，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020 年9 月—2022 年3 月承德医学院附属医院胸外科诊治的，做过手术切除且经过病理学诊断后确诊肺腺癌患者60 例。纳入标准：①手术前均未接受过任何放化疗及免疫治疗。②临床资料完整。排除标准：①伴有严重感染、严重肝功能异常或严重肾功能异常者；②合并其他恶性肿瘤的患者或有其他恶性肿瘤史者；③肿瘤切除术后，术后辅助治疗开始前出现疾病复发进展、死亡患者。60 例患者中男23 例、女37 例；≥60 岁38 例，＜60岁22 例；吸烟21 例，不吸烟39 例；按IASLC 第八版制定的标准进行TNM 分期为Ⅰ期23 例，Ⅱ期24 例，Ⅲ期13 例；组织学分级为高分化8例，中分化41例，低分化11 例；出现局部淋巴结转移22 例，无淋巴结转移38例。60例患者均行肿瘤切除术，术中留取癌组织、癌旁肺组织（距癌组织边缘＞6 cm，病理证实无癌组织）。本研究已经得到承德医学院医学伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 MDM2和KAT5抗体购自于河北石家庄健菲生物科技有限公司；免疫组化试剂盒购自于广州德咏信生物科技有限公司；山羊血清、DAB显色试剂盒购自于河北贝博实验用品有限公司。Alexa Fluor 488-conjugated 羊抗兔荧光抗体、ATTO 594-conjugated 羊抗鼠荧光抗体和抗荧光淬灭封片剂购自河北贝博实验用品有限公司。

1.3 肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5 蛋白检测

1.3.1 肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5 蛋白定位检测 采用荧光免疫组织化学法（IF）。组织切片常规脱蜡水化，PBS 清洗后，抗原修复暴露抗原表位，5% 山羊血清封闭，甩去多余液体；加一抗（MDM2 1∶300，KAT5 1∶300），4 ℃过夜，室温复温；PBST 清洗；加荧光二抗（羊抗兔荧光抗体1∶200、羊抗鼠荧光抗体1∶200），孵育1 h，PNST 清洗；DAPI 染色5 min，PBST 清洗3次3 min；滴加抗荧光淬灭封片剂封片。荧光显微镜下根据荧光的分布位置及强度，确定MDM2、KAT5 蛋白的定位。每张标本随机取5 个不重复高倍视野。结果判定标准：明场视野下确定组织位置，DAPI 下确定细胞核，以定位在细胞膜和（或）细胞质，绿色荧光信号确定KAT5 蛋白表达，红色荧光信号确定MDM2蛋白表达。

1.3.2 肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5 蛋白定量检测 采用免疫组织化学（IHC）法。取肺腺癌组织及癌旁组织标本石蜡连续切片，所有操作严格按照试剂盒说明书进行。DAB 显色，显微镜下控制显色时间。流水冲洗，苏木素复染核，中性树脂封片固定。以山羊血清替代一抗做阴性对照，已知阳性病例做阳性对照。MDM2、KAT5 主要表达于细胞质中，少量表达于细胞核，将细胞核与细胞质中呈现棕黄色定为阳性，每张切片在光学显微镜下连续观察10 个高倍视野。结果判定标准：阳性细胞染色定位在细胞膜和（或）细胞质，呈淡黄色、棕褐色颗粒。根据阳性细胞染色强度与阳性细胞数百分比进行评分。首先根据染色强度打分：无色计0分、淡黄色计1 分、棕黄色计2 分、棕黑色计3 分 ，＞1 分的为阳性细胞；再根据阳性细胞所占比例评分：阳性细胞率＜5%计0 分，5%～25%计1分，25%～50%计2分，50%～75%计3分，＞75%计4分； 2 项评分的乘积进行表达定量分级：0～3 为阴性表达，＞3 为阳性表达。测算肺腺癌组织及癌旁组织MDM2、KAT5细胞阳性率，阳性表达率为该组阳性表达数占该组总数的比例。

1.4 统计学方法 采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据处理。计量资料符合正态分布、方差齐时以-x±s表示，组间比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Spearman 相关检验法分析肺腺癌组织KAT5、MDM2 表达的相关性。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺腺癌组织及癌旁组织KAT5、MDM2 定位情况 癌旁组织KAT5、MDM2 多数荧光强度不明显，肺腺癌组织中KAT5 与MDM2 均呈高表达，主要表达于细胞质中，少量表达于细胞核。

2.2 肺腺癌组织及癌旁组织KAT5、MDM2 阳性表达率比较 肺腺癌组织及癌旁组织KAT5 阳性表达率分别为65.00%（39/60）、45.00%（27/60），二者比较，P＜0.05。 肺腺癌组织及癌旁组织；MDM2 阳性表达率分别为78.33%（47/60）、40.00%（24/60），二者比较，P＜0.05。

2.3 不同临床病理参数肺腺癌患者癌组织KAT5、MDM2阳性表达情况比较 不同临床病理参数肺腺癌患者阳性KAT5、MDM2 阳性表达情况见表1。KAT5 阳性表达与肺腺癌患者的性别、年龄和吸烟与否无关（χ2分别为0.280、2.300，0.587；P均＞0.05），与肺腺癌患者TNM 分期、肿瘤分化和淋巴结转移相关（χ2分别为14.336、6.507、4.319；P均＜0.05）；MDM2 高表达与肺腺癌患者TNM 分期、肿瘤分化和淋巴结转移相关（χ2分别为11.231、9.133、6.000；P均＜0.05），与肺腺癌患者患者性别、年龄和吸烟与否均无关（χ2分别为0.000、1.320、0.131；P均＞0.05）。

表1 不同临床病理参数肺腺癌患者癌组织KAT5、MDM2阳性表达情况（例）

2.4 KAT5 与MDM2 在肺腺癌组织中表达的相关性 Spearman 相关分析显示，肺腺癌组织中KAT5蛋白表达与MDM2 蛋白表达呈正相关（r=0.632，P＜0.05）。

3 讨论

因肺癌发病隐匿且缺乏有效的早期筛查的分子标记物，部分肺癌患者发现时处于中晚期，影响患者的总体生存率和预后［7］。

KAT5 属于组蛋白乙酰化酶中的一员，在DNA修复、细胞凋亡和蛋白乙酰化修饰中发挥着重要的作用。KAT5 可以作为乙酰基转移酶通过乙酰化修饰肿瘤相关蛋白质，使其发生活性或功能改变，进而调控细胞的生长、信息传递及对环境因素刺激的应答反应等［8］。VAN DEN 等［9］报告发现，KAT5在顺铂耐药的人肺癌细胞中过度表达，KAT5 表达的下调使细胞对顺铂治疗敏感，并发现非小细胞肺癌的发生和H4K5 和H4K8 的大量乙酰化以及H4K12 和H4K16 的乙酰化减少有关。HPATEL 等［10］研究发现KAT5 在体内乙酰化C-MYC 参与C-MYC 激活，并确定KAT5通过乙酰化提高C-MYC蛋白稳定性可能在肺癌的发生中起促进作用。本研究结果表明，KAT5在肺腺癌组织中表达上调，且KAT5 阳性表达与肺腺癌TNM 分期、分化程度和淋巴结转移密切相关。这提示，KAT5 在肺腺癌发生和发展过程中起到促进作用，可能通过乙酰化下游相关蛋白通过多种途径参与了肺腺癌的恶性转化。

MDM2 是肿瘤抑制因子p53 的负调节因子，转录因子p53 通过参与DNA 修复、细胞周期停滞、细胞衰老、细胞死亡、细胞分化和代谢来充当关键的肿瘤抑制因子［11］。MDM2 基因编码的E3 泛素连接酶可通过诱导下调促凋亡蛋白BAX 和上调抗凋亡蛋白Bcl-2 以及抑制一些肿瘤抑制因子（包括p53、PTEN、p14ARF、GKN1和JWA）来抑制细胞凋亡进而参与肿瘤的发生［12］。MDM2基因扩增或MDM2蛋白表达改变是许多肿瘤的特征［13］。MDM2在多种肿瘤中呈高表达，且高表达与多种肿瘤的增殖、侵袭和迁移相关。ENDO 等［14］发现MDM2 抑制剂nutlin-3 与顺铂或5-氟尿嘧啶联合使用时具有抗肿瘤作用，并引发协同细胞毒性作用。NING 等［15］证实在肺癌顺铂耐药性的研究中ZCCHC10 可以减弱MDM2 介导的P53 泛素化降解抑制肿瘤进展。本研究结果表明，MDM2 在肺腺癌组织中表达明显上调；MDM2 阳性表达与肺腺癌的TNM 分期、肿瘤分化和淋巴结转移相关；MDM2 在肿瘤有淋巴结转移者中表达明显升高，提示其可能促进了肺腺癌细胞自身的增殖、侵袭和迁移能力，进而使肺腺癌的恶性程度增强，导致其容易通过淋巴结发生转移。

MDM2 存在与KAT5 特异性结合的泛素化结合位点，可以通过泛素—蛋白酶体途径调节KAT5 的降解［8］。DOHMESEN 等［16］研究证实，MDM2与KAT5存在相互作用，KAT5 可以作为MDM2 介导的DNA损伤的特异性抑制物，但不能阻止MDM2 介导的泛素化。 DENG 等［17］发现Hp 感染诱导的MDM2 mRNA 的ac4C乙酰化，稳定MDM2 mRNA，导致MDM2 上调和p53 降解，从而促进胃癌的发生，提示MDM2基因存在乙酰化位点。有研究表明乙酰转移酶p300/CBP 相关因子（PACF）可以调控MDM2的蛋白水平来控制P53 蛋白的稳定性和活性，在能量缺乏时，增强了PACF的E3泛素连接酶活性，用于结合并降解MDM2 蛋白，稳定P53诱导细胞周期阻滞。本研究通过实验证实，KAT5与MDM2在肺腺癌中同时呈现高表达状态，二者主要表达于细胞质中。通过进一步统计分析KAT5 与MDM2 的相关性，结果提示在肺腺癌组织中KAT5 与MDM2 的阳性表达具有相关性，且呈正相关性，说明二者在肺腺癌的发生发展过程中可能起到相互促进作用。进一步推测，二者相互作用的可能的途径：一是KAT5 通过介导MDM2 的乙酰化来增强表达，通过依赖或非依赖P53 途径发挥促癌作用；二是通过MDM2 介导KAT5的泛素化过程，参与肿瘤调控。KAT5存在与MDM2特异性结合的泛素化结合位点，二者同时高表达于肺腺癌组织，可能二者存在特异性调节失常并导致KAT5 无法被MDM2 正常泛素化降解，使KAT5 蛋白表达水平上升导致乙酰化失衡，进而参与肺腺癌的发生和发展。

综上所述，肺癌组织中KAT5 与MDM2 呈高表达。KAT5 与MDM2 阳性表达与肺腺癌患者的TNM分期、肿瘤分化和淋巴结转移，二者可能协同促进肺腺癌的发生发展。但KAT5 与MDM2 在肺腺癌发生发展中的具体分子生物学机制仍需进一步深入研究，以便为肺腺癌的基因靶向治疗提供新的理论依据。