茯苓酸对人骨肉瘤细胞系MG-63的增殖凋亡、迁移侵袭影响及PERK/CCAAT信号通路调控作用

施擎宇，黄帆，王冬明

上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科，上海 200032

骨肉瘤是骨科常见的恶性肿瘤之一，多发于股骨、胫骨、骨盆等部位，具有高度异质性［1-2］。目前临床治疗骨肉瘤主要方法有外科手术切除、放射治疗、化学药物治疗、靶向分子治疗等，但由于化疗药物的不良反应较多且严重，手术治疗后患者肢体功能表现差异加大，故寻找不良反应低、安全有效的新型治疗药物和治疗方法是目前的研究热点［3-4］。茯苓酸（pachymic acid，PA）是中药茯苓的主要活性成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗高血糖、抗病毒及镇静催眠等多种药理作用［5］。PA 可抑制胃癌、肝癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤的增殖、迁移。但PA 对骨肉瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响目前尚未有研究报道。在肿瘤细胞快速生长过程中，缺氧、营养物质匮乏等进一步导致大量未折叠或错误折叠的蛋白质聚集于内质网中，形成内质网应激，并启动未折叠蛋白反应（UPR）［6］。蛋白激酶R 样内质网激酶（PERK）/CCAAT 增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/CHOP）信号通路在内质网应激中发挥重要作用，可通过上调CHOP、Bcl-2和其他细胞凋亡因子的表达诱导细胞凋亡［7-8］。PA 是否通过调控PERK/CHOP 信号通路影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡，目前尚未有相关研究报道。为此，我们观察了PA 对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响，并探讨其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂及仪器 人骨肉瘤细胞系MG-63购自中国科学院细胞库。PA 购自上海晶都生物技术有限公司；PERK 抑制剂GSK2606414 购自湖南华腾制药有限公司；胎牛血清、高糖DMEM 培养基、胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher 公司；MTT 试剂购自北京索莱宝科技有限公司；Transwell 小室购自Corning公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自德国Merck 公司；TRIzol 试剂、反转录试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自美国Invitrogen 公司；RT-qPCR 试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司；PERK、p-PERK、真核生物起始因子2α（eIF2α）、p-eIF2α、活化转录因子4（ATF4）、CHOP、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、BCL2相关X蛋白（Bax）、GAPDH一抗和相应二抗购自上海艾博抗贸易有限公司。

1.2 PA 受试浓度筛选 取对数生长期的MG-63细胞接种于96 孔板中（2×104个/孔），分为5 组，每组6个复孔，加入终浓度为0、5、10、20、40、80、160 μmol/L 的PA 处理48 h，每孔加入10 μL 的MTT溶液，孵育4 h，再加入100 μL DMSO溶液，用酶标仪测算各组570 nm 处吸光度值（OD570nm），测算各组细胞增殖活力（%）。结果显示，与0 μmol/L 比较，40、80、160 μmol/L 的PA 可显著降低MG-63 细胞的增殖活力（P均＜0.05），且160 μmol/L 的PA 对MG-63 细胞增殖活性的影响与80 μg/mL 的PA 接近。因此，最终选择20、40、80 μmol/L 的PA 进行后续实验。

1.3 MG-63细胞分组及PA 给予方法 取对数生长期MG-63 细胞，5×103/孔接种于96 孔板中，待细胞贴壁后随机分为低浓度PA 组（PA-L 组）、中浓度PA组（PA-M 组）、高浓度PA 组（PA-H 组）、高浓度PA +PERK 抑制剂GSK2606414 组（PA-H + GSK2606414组）及对照组，每组6 个复孔。PA-L 组、PA-M 组、PA-H 组分别加入终浓度20、40、80 μmol/L 的PA［9］培养，PA-H + GSK2606414 组加入终浓度40 μmol/L 的PA + 5 μmol/L 的GSK2606414［10］培养，对照组用空白培养基培养。

1.4 各组细胞增殖情况观察 采用MTT 法。分别于培养24、48 及72 h 时取各组细胞，每孔加入10 μL 的5 g/L MTT 溶液，继续培养4 h 后弃上清，加入100 μL 的DMSO 溶液，振摇后培养10 min，待底部结晶完全溶解后，采用酶标仪测算570 nm 处的吸光度OD570nm值，以OD570nm代表细胞的增殖能力。实验重复测算3 次，取平均值。

1.5 各组细胞迁移情况观察 采用划痕实验。培养24 h 时取各组细胞，用无菌20 μL 移液枪枪头垂直画出一道划痕，之后用PBS 洗涤细胞3次，继续培养48 h，用倒置显微镜观察0、48 h 时各组细胞的迁移情况，并使用Image J 软件进行分析测算各组细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h宽度-48 h 宽度）/0 h 宽度×100%。实验重复测算3 次，取平均值。

1.6 各组细胞侵袭情况观察 采用Transwell 实验。培养48 h 时取各组细胞，5×104/mL 加入150 μL细胞悬液到Transwell 小室上室（稀释的Matrigel 基质胶包被）中。利用倒置光学显微镜观察，每个小室随机选取6个视野进行拍照，并进行侵袭细胞计数。实验重复测算3次，取平均值。

1.7 各组细胞凋亡情况观察 采用流式细胞术。培养48 h时取各组细胞，胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液后离心收集细胞，用PBS 洗涤2 次。加入100 μL 的 1×Binding Buffer 重悬细胞，之后分别加入5 μL 的 Annexin V-FITC 和5 μL PI 于室温下避光反应20 min。采用流式细胞仪测算各组细胞凋亡率。实验重复测算3次，取平均值。

1.8 各组细胞PERK mRNA、CHOP mRNA 检测 采用RT-qPCR 法。培养48 h 时取各组细胞，加入TRIzol 试剂提取细胞总RNA。根据反转录试剂盒说明书，将总RNA 反转录为cDNA，并进行PCR 扩增。PCR 扩增反应条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循环40 次。引物序列设计如下：PREK 上游引物：5’-ACGATGAGACAGAGTTGCGAC-3’，下游引物：5’-ATCCAAGGCAGCAATTCTCCC-3’；CHOP上游引物：5’-CTTGACCCTGCTTCTCTGGCTT-3’，下游引物：5’-TTCCGTTTCCTGGTTCTCCCTT-3’；β-actin上游引物：5’-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物：5’-CAGGAAGGAAGGCTGGAAG-3’。以β-actin 为内参，以2-ΔΔCt代表PERK mRNA、CHOP mRNA 的相对表达量。实验重复测算3 次，取平均值。

1.9 各组胞PERK/CHOP 信号通路相关蛋白与凋亡相关蛋白检测 采用WESTERN Blotting 法。培养48 h时取各组细胞，加入RIPA蛋白裂解液提取细胞总蛋白。根据BCA 蛋白定量试剂盒操作说明测定总蛋白浓度。定量蛋白经10% SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜、脱脂奶粉封闭后将膜与p-PERK（1∶500）、PERK（1∶500）、p-eIF2α（1∶500）、eIF2α（1∶500）、ATF4（1∶200）、CHOP（1∶500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗（1∶5 000）在室温下孵育2 h，加入ECL化学发光剂进行显色。以GAPDH 作为内参，在凝胶成像仪下进行曝光，利用Image Lab 软件测算目标蛋白的灰度值，以灰度值代表目的蛋白的相对表达量。实验重复测算3 次，取平均值。

1.10 统计学方法 采用SPSS 25.0 统计软件进行数据处理。计量资料通过Shapiro-Wilk 进行正态性检验，符合正态分布的数据以-x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞OD570nm值比较 培养24、48、72 h 时各组细胞OD570nm值比较见表1。

表1 培养24、48、72 h时各组MG-63细胞OD570nm值比较（±s）

表1 培养24、48、72 h时各组MG-63细胞OD570nm值比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与PA-L组比较，#P＜0.05；与PA-M组比较，&P＜0.05；与PA-H组比较，△P＜0.05。

组别PA-L组PA-M组PA-H组PA-H + GSK2606414组对照组OD570nm值培养72 h 0.83 ± 0.08 0.66 ± 0.06*#0.43 ± 0.04*#&0.69 ± 0.07△0.87 ± 0.08培养24 h 0.27 ± 0.02 0.26 ± 0.03 0.25 ± 0.02 0.26 ± 0.02 0.28 ± 0.03培养48 h 0.59 ± 0.06 0.48 ± 0.04*#0.31 ± 0.03*#&0.52 ± 0.05△0.63 ± 0.06

2.2 各组细胞迁移率比较 PA-L 组、PA-M 组、PA-H 组、PA-H + GSK2606414 组及对照组细胞迁移率分别为51.07% ± 4.96%、40.27% ± 4.25%、26.28% ± 2.91%、45.34% ± 4.66%^、54.20% ±5.89%，与对照组比较，PA-M 组、PA-H 组细胞的细胞迁移率低（P 均＜0.05）；与PA-L 组比较，PA-M 组、PA-H 组细胞迁移率低（P均＜0.05）；与PA-M 组比较，PA-H 组细胞迁移率低（P＜0.05）；与PA-H 组比较，PA-H + GSK2606414 组细胞迁移率高（P＜0.05）。

2.3 各组细胞侵袭数比较 PA-L 组、PA-M 组、PA-H 组、PA-H + GSK2606414 组及对照组细胞侵袭数分别为（104.35 ± 7.54）、（83.81 ± 6.38）、（59.92 ± 5.33）、（87.64 ± 6.89^）、（112.59 ± 8.20）个/视野。与对照组比较，PA-M 组、PA-H 组细胞侵袭数目少（P均＜0.05），PA-L 组无显著性差异（P＞0.05）；与PA-L 组比较，PA-M 组、PA-H 组细胞的细胞侵袭数少（P均＜0.05）；与PA-M组比较，PA-H组细胞的细胞侵袭数少（P＜0.05）；与PA-H组比较，PA-H+ GSK2606414组细胞的细胞侵袭数多（P＜0.05）。

2.4 各组细胞凋亡率比较 PA-L 组、PA-M 组及PA-H 组、PA-H + GSK2606414 组及对照组细胞迁移率分别为6.21% ± 0.69%、13.54% ± 0.95%、22.36% ± 1.47%、12.04% ± 0.85%△、4.67% ±0.63%，与对照组比较，PA-M 组、PA-H 组细胞凋亡率高（P均＜0.05）；与PA-L 组比较，PA-M 组、PA-H组细胞凋亡率高（P均＜0.05）；与PA-M组比较，PA-H组细胞凋亡率高（P＜0.05）；与PA-H 组比较，PA-H +GSK2606414组细胞凋亡率低（P＜0.05）。

2.5 各组细胞PERK mRNA、CHOP mRNA 相对表达量比较 各组细胞PERK mRNA、CHOP mRNA 相对表达量比较见表2。

表2 各组细胞PERK mRNA、CHOP mRNA相对表达量比较（±s）

表2 各组细胞PERK mRNA、CHOP mRNA相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与PA-L 组比较，#P＜0.05；与PA-M组比较，&P＜0.05；与PA-H组比较，△P＜0.05。

CHOP mRNA 1.05 ± 0.09 1.53 ± 0.15*#1.92 ± 0.19*#&1.50 ± 0.15△1.00 ± 0.00组别PA-L组PA-M组PA-H组PA-H + GSK2606414组对照组PERK mRNA 1.08 ± 0.08 1.42 ± 0.14*#1.87 ± 0.19*#&1.38 ± 0.14△1.00 ± 0.00

2.6 各组细胞PERK/CHOP 信号通路与凋亡相关蛋白表达比较 各组细胞p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Bax、Bcl-2 蛋白相对表达量比较见表3。

表3 各组细胞PERK/CHOP信号通路与凋亡相关蛋白相对表达量比较（±s）

表3 各组细胞PERK/CHOP信号通路与凋亡相关蛋白相对表达量比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与PA-L组比较，#P＜0.05；与PA-M组比较，&P＜0.05；与PA-H组比较，△P＜0.05。

组别PA-L组PA-M组PA-H组PA-H + GSK2606414组对照组Bcl-2 0.74 ± 0.07 0.47 ± 0.05*#0.26 ± 0.03*#&0.56 ± 0.05△0.78 ± 0.07 p-PERK/PERK 0.28 ± 0.03 0.48 ± 0.04*#0.79 ± 0.07*#&0.43 ± 0.04△0.24 ± 0.02 p-eIF2α/eIF2α 0.25 ± 0.02 0.53 ± 0.05*#0.83 ± 0.08*#&0.49 ± 0.05△0.21 ± 0.02 ATF4 0.29 ± 0.03 0.55 ± 0.05*#0.81 ± 0.08*#&0.51 ± 0.05△0.26 ± 0.03 CHOP 0.35 ± 0.03 0.59 ± 0.06*#0.92 ± 0.09*#&0.54 ± 0.05△0.32 ± 0.03 Bax 0.30 ± 0.03 0.61 ± 0.06*#0.88 ± 0.08*#&0.57 ± 0.06△0.28 ± 0.03

3 讨论

骨肉瘤属于原发性的恶性肿瘤，常发于儿童或青少年人群，且骨肉瘤的复发率与转移率较高，手术切除治疗骨肉瘤的预后不佳［11］。

PA 是茯苓中提取的主要活性成分，其抗肿瘤作用受到广泛关注。樊燕青等［12］研究发现PA 能通过抑制CXCR4 表达降低舌鳞状细胞癌CAL-27 细胞增殖，并诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。JIANG 等［13］研究发现PA 抑制了肝癌细胞HepG2 和Huh7 的生长与迁移。本研究结果发现，40、80 μmol/L 的PA处理可对照组比较降低MG-63 细胞增殖活力、细胞迁移率、细胞侵袭数目以及细胞Bcl-2 蛋白表达，升高细胞凋亡率和细胞Bax 蛋白表达；这些结果均说明PA 对骨肉瘤MG-63 细胞的增殖、迁移、侵袭具有抑制作用，并可诱导其凋亡，表明PA 可能作为治疗骨肉瘤的潜在药物。

在内质网应激反应早期阶段，为了维持细胞正常功能，细胞将阻止未折叠蛋白合成或促进正确的蛋白折叠；当适应性反应不足以克服内质网应激时，细胞凋亡途径将被启动，并激活CHOP、Bcl-2 的表达，即激活PERK/CHOP 信号通路促进细胞凋亡［14］。当PERK/CHOP 信号通路启动时，激活的PERK 会引发UPR 相关促凋亡信号的启动，提高磷酸化eIF2α 水平，激活ATF4 并启动适应性信号通路，抑制蛋白质合成和翻译；CHOP 过表达可以下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax 蛋白表达，诱导细胞凋亡［15］。YANG 等［16］研究发现PA 能通过诱导内质网应激，抑制宫颈癌细胞增殖、迁移，并诱导其凋亡，起到抗宫颈癌作用，表明PA可通过调控内质网应激发挥抗癌活性。在本研究中，40、80 μmol/L 的PA 处理可上调MG-63 细胞中比较PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白表达和eIF2α磷酸化水平，降低Bcl-2蛋白表达，说明PA 对骨肉瘤细胞MG-63 细胞恶性生物学行为的抑制作用可能与激活PERK/CHOP 信号通路有关。本研究在80 μmol/L的PA 处理的基础上使用PERK 抑制剂GSK2606414 干预MG-63 细胞，结果显示，GSK2606414 减弱了80 μmol/L 的PA 对MG-63 细胞增殖、侵袭和凋亡的作用；提示PA 可能通过激活PERK/CHOP 信号通路抑制骨肉瘤细胞MG-63 细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡。

综上所述，PA 可抑制可能通过激活PERK/CHOP 信号通路表达，抑制MG-63 细胞增殖、侵袭和迁移，促进细胞的凋亡。然而，本研究只在细胞水平上初步探究了PA 的抗骨肉瘤作用及PERK/CHOP信号通路在其中的作用，后续还需进一步深入研究。