酶解超声结合提取虎杖中白藜芦醇及纯化方法研究

付培蕾 邱明恒 冯爽 李阳杰

白藜芦醇（Resveratrol，RES）是一种从植物中提取的二苯乙烯结构的多酚，最初是从百合科藜芦属的毛叶藜芦中得到的，后来发现在虎杖、葡萄、花生中也有其成分，而虎杖中含量最高。白藜芦醇的化学名称为（E）-3，5，4-三羟基二苯乙烯，分子式为C14H12O3，相对分子质量为228.4g·mol-1，难溶于水，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯以及氯仿、乙醚等有机溶剂。白藜芦醇在自然条件下以自由态和糖苷两种形式存在，白藜芦醇及其糖苷的化学结构还分别存在顺式和反式两种异构体，白藜芦醇的活性大于其苷，纤维素酶可将白藜芦醇苷水解为白藜芦醇。白藜芦醇对乳腺癌、胃癌、结肠癌、黑色素癌细胞等均有显著抑制作用，还具有抗衰老、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗喘、防治心血管疾病等多种生理活性。本实验采用纤维素酶解结合超声法提取虎杖中的白藜芦醇，从而得到一种低能耗、高产率的提取虎杖中白藜芦醇的工艺。

一、仪器与材料

1.仪器。超声波清洗机；紫外可见分光光度计，岛津UV2600；高效液相色谱仪，岛津LC-20A；半制备高效液相色谱仪，Waters2535；红外分光光度计，热电iS50。

2.材料。虎杖（产地江西，经原河南中医药大学教授王建刚教授鉴定为虎杖）；白藜芦醇（质量分数为98%的对照品）；纤维素酶，甲醇（GR、AR），无水乙醇（AR），乙酸乙酯（AR），三氯甲烷（AR），冰醋酸（GR），柠檬酸，柠檬酸三钠，无水乙醚（GR），丙酮（AR），乙腈（GR）。

二、实验与方法

1.紫外分光光度法方法学的建立。（1）白藜芦醇含量测定方法的建立。本实验采用紫外可见分光光度法测定虎杖提取物中白藜芦醇类粗提物的含量。

（2）对照品溶液的配制。称取白藜芦醇对照品1.0mg，加适量甲醇溶解，配制成100?g·mL-1的白藜芦醇对照品溶液。

（3）标准曲线的绘制。分别配制浓度为1、2、4、6、8?g·mL-1的白藜芦醇对照品溶液，使用紫外分光光度计在306nm处测定白藜芦醇的吸光度，以浓度C为横坐标，以吸光度绝对值A为纵坐标，进行线性回归，计算回归方程与相关系数。

（4）供试品溶液的配制。称取虎杖粉末（过60目）2.00g，加入适量纤维素酶，量取适量pH=5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，于一定温度下酶解一定时间。取出后加入适量乙醇溶液，超声提取一定时间后抽滤，蒸干得浸膏。加入适量甲醇溶解，转移于50mL容量瓶中，稀释至刻度。精密吸取上述溶液0.1mL，转移至10mL容量瓶中，稀释至刻度，于306nm处测吸光度值，根据如下公式计算提取率：

提取率=C×V×稀释倍数/m

C为被测样品中白藜芦醇的浓度（?g·mL-1），V为样品最终定容体积（mL），m为虎杖的质量（mg）。

2.提取单因素考察。酶添加量分别考察0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，酶解时间分别考察0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，酶解温度分别考察40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，酶解pH分别考察3.4、4.0、4.4、5.0、5.4，乙醇浓度分别考察50%、60%、70%、80%、90%，液料比分别考察10：1、15：1、20：1、25：1、30：1，超声时间分别考察20min、30min、40min、50min、60min，其他条件不变进行初步试验。

3.响应面设计筛选最佳提取工艺。根据单因素实验结果，选取影响较大的因素，以粗提取物的提取率为因变量，使用Design-Expert软件进行响应面设计，筛选出最佳提取工艺。

4.最佳工艺重复性试验。根据响应面设计得出的最佳提取工艺，重复进行6次实验，以白藜芦醇含量为参照计算粗提物的提取率。

5.粗提物的分离与纯化。（1）乙酸乙酯初步除杂。将初步提取的溶液抽滤，旋转蒸发除去乙醇得浸膏，加入适量甲醇溶解，粗提物用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，除去多糖、苷类等极性较大的杂质，实现初步纯化。

（2）薄层鉴定。将白藜芦醇标准品溶液、萃取前提取液、萃取后提取液分别点样20μL于硅胶G板上，以氯仿：丙酮：乙醇：水（4：4：0.5：0.2）为展开剂，于365nm波长处紫外灯下观察，观察到初步除杂后目标单体的存在。

（3）高效液相方法学建立。①色谱条件。色谱柱为Agilent SB-C18（150mm×4.6，5μm），流动相为乙腈：0.2%冰醋酸（64.8：35.2）。②专属性考察。称取适量空白溶剂、白藜芦醇对照品，加入色谱甲醇配制成一定浓度的白藜芦醇标准品溶液进样测定。③标准曲线的建立。配制浓度为0.2、2、10、20、40、50?g·mL-1的白藜芦醇标准溶液，分别进样测定，以RES的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线。④回收率、日间日内精密度、重复性实验。分别取浓度为10、20、50?g·mL-1的低、中、高三个水平的白藜芦醇标准溶液进行进样测定，根据所得峰面积计算相应浓度，并与理论浓度进行对比，计算回收率与RSD。1天内每个浓度测定6次，连续测定6天，考察日间日内精密度。平行3次，计算RSD，考察重复性。

（4）制备型高效液相制备及单体纯度測定。使用Waters2535半制备型高效液相色谱仪，分别进白藜芦醇标准品溶液和乙酸乙酯萃取后样品液，观察半制备液相图谱，取制得样品测得单体纯度。

6.结构鉴定。通过红外光谱图和核磁共振氢谱图，对分离的单体进行结构鉴定。

三、结果与分析

1.白藜芦醇标准曲线。由图1可知，白藜芦醇的浓度与吸光度的线性回归方程为Y=0.1212X-0.0046，相关系数为R=0.9997，表明白藜芦醇在1-8?g·mL-1范围内线性关系良好。

图1：白藜芦醇标准曲线

2.单因素考察试验结果。由图2可知，对白藜芦醇提取率影响较大的是酶解温度和酶解pH，因此可选择进行响应面实验设计。

3.响应面实验结果。根据单因素实验选取酶解温度和酶解pH作为响应面实验设计的两个因素，每个因素三个水平，进行12组实验。对实验结果采用Design Exepert软件进行回归拟合，得到提取率对酶解温度和pH的回归方程为Y=1.20-0.019A-0.023B+0.033AB-0.14A?-0.10B?（R=0.9952）。

根據中心组合设计试验所得二维等高线图和三维响应曲面图（图3），确定最佳提取工艺条件，可知白藜芦醇提取率的理论最大值为1.20%，所对应的提取条件为：纤维素酶添加量0.2%，纤维素酶解时间1.5h，纤维素酶解温度49℃，纤维素酶解pH=3.8，乙醇浓度70%，液料比20：1，超声时间40min。

4.最佳工艺重复性结果。响应面筛选出的最佳工艺重复性良好，RSD均小于2.0%，说明此工艺较稳定可靠。

5.粗提物的纯化与分离鉴定。（1）薄层鉴定结果。乙酸乙酯萃取后，与标准品白藜芦醇的Rf值相近的荧光斑点仍存在，表明白藜芦醇仍保留在乙酸乙酯层。

（2）专属性结果。由图4可知，溶剂对检测没有影响，白藜芦醇标准品的保留时间在7.5min，说明专属性较好，因此可以使用此条件下的检测方法测定白藜芦醇的含量。

（3）高效液相标准曲线。根据高效液相色谱仪所得数据，白藜芦醇峰面积与浓度的线性拟合方程为Y=152980X-14767，相关系数R=0.9999，说明白藜芦醇在0.2-50?g·mL-1范围内具有良好的线性关系，符合检测要求。

（4）回收率、日间日内精密度、重复性实验结果。由表1可知，三个水平浓度的白藜芦醇标准品溶液的回收率均在98%-102%，RSD均小于2.0%，日内日间精密度、重复性的RSD均小于2.0%，说明此条件下测定的方法精密度和重复性较好，因此可以采用此条件下的测定方法测定白藜芦醇的含量。

（5）半制备高效液相分离结果。以乙腈：水（40：60）为流动相，2mL·min-1流速进样测定，与白藜芦醇标准品对照，根据标准品的保留时间收集目标产物，测得单体质量分数为97.83%。

由图5可知，此色谱条件下白藜芦醇标准品的保留时间为8.23min，萃取物中有多种成分，其中保留时间为8.23min的峰为白藜芦醇，收集此保留时间的样品，真空干燥得粉末。

（6）单体的结构鉴定。由红外表征结果（图6）可知，a中3284cm-1和b中3285cm-1是分子间羟基形成氢键缔合的特征峰，a中3022cm-1和b中3021cm-1是芳氢的伸缩振动峰，1592cm-1-1449cm-1是苯环骨架振动的特征峰。

图6：红外光谱图

注：a.白藜芦醇对照品；b.提取物分离单体

图7：核磁共振氢谱图

注：A.白藜芦醇标准品；B.提取物分离单体

由核磁结果（图7）可知，分离单体的核磁共振氢谱与白藜芦醇标准品的核磁共振氢谱基本一致，各峰的化学位移如下：a处酚羟基峰的化学位移为9.54ppm（s，1H），b处两个化学环境相同的酚羟基质子的化学位移为9.22ppm（s，2H），乙烯基上的两个质子峰分别为d处6.94ppm（d，1H，J=16HZ）和e处6.82ppm（d，1H，J=16HZ），苯环上的质子峰分别为c处7.40ppm（d，1H，J=16HZ）、f处6.76ppm（d，2H，J=16HZ）、g处6.39ppm（s，2H）、h处6.12ppm（s，1H）。所收集样品经与白藜芦醇标准品核磁共振氢谱对照，基本确定样品即为白藜芦醇。

四、讨论与结论

采用紫外分光光度法测定白藜芦醇的含量，白藜芦醇含量在1-8?g·mL-1范围内呈现良好的线性关系。通过单因素实验和响应面设计筛选出虎杖中白藜芦醇的最佳提取工艺为：酶解温度49℃，pH=3.8，酶添加量0.2%，酶解时间1.5h，乙醇浓度70%，液料比20：1，超声时间40min。此条件下白藜芦醇提取率达1.19%，在环保节能的基础上进一步提高了提取率。

将初步纯化的提取物进行分离，并与白藜芦醇对照品对照，根据保留时间收集目标产物，测得单体质量分数为97.83%。再通过红外光谱及核磁共振氢谱对收集样品进行结构鉴定，经与白藜芦醇对照品对照，基本确定样品即为分离所得白藜芦醇单体。

基金项目：教育部产学研项目“移动互联网时代下药学专业教学改革研究”（20202028026）。

作者简介：付培蕾（1995-），女，汉族，河南郑州人，助教，硕士研究生，研究方向为药事管理与中药制剂开发。

邱明恒（1995-），女，汉族，河南郑州人，助教，硕士研究生，研究方向为药物评价与药事管理。

冯爽（1986-），女，汉族，河南郑州人，讲师，硕士研究生，研究方向为药物评价与药事管理。

李阳杰（1986-），男，汉族，河南郑州人，副教授，硕士研究生，研究方向为药事管理与药品质量标准。