干细胞源性细胞外囊泡经RANKL/RANK/OPG通路促进牙槽骨成骨的研究进展*

黄霞，魏津钿，苏琪，周志迎，项琪

（1.暨南大学 口腔医学院，广东 广州 510632；2.暨南大学第一附属医院 口腔科，广东 广州 510630；3.暨南大学 生物医药研究院，广东 广州 510632）

细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）作为细胞间通讯的传递者，是细胞释放的包含重要生物信息的双层脂质囊泡。干细胞经旁分泌释放的细胞外囊泡（stem cell-derived extracellular vesicles,SC-EVs）在修复损伤和组织再生方面具有重要作用。在功能上，SC-EVs抑制炎症反应和修复再生组织；在生物安全方面，SC-EVs的无细胞移植形式显著降低了自我排斥的风险[1]。SC-EVs增强成骨相关的因子表达，激活核因子κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）/核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB,RANK）/骨保护素（recombinant osteoprotegerin,OPG）信号通路，促进成骨反应。运用SC-EVs治疗临床牙槽骨不足、促进牙槽骨成骨修复，是未来有利的治疗方法。

1 SC-EVs概述

1.1 EVs的生物学特性

EVs广泛存在于人体各种体液中，携带多种生物活性物质，包括DNA、mRNA、miRNA、脂类、蛋白质等，特定mRNA和miRNA的水平转移是EVs诱导受损组织的表观遗传重编程和加速再生的关键[2]。EVs在生物物质的成分和组成上的差异决定了EVs功能的特异性。根据发生机制和直径大小，EVs主要分为微囊泡、外泌体和凋亡小体。微囊泡是质膜直接向外出芽形成，直径在100～1 000 nm；外泌体的直径在30～150 nm，其形成是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放的膜性小泡；凋亡小体是细胞在凋亡过程中释放的、直径为50～2 000 nm的细胞外囊泡[3]。其中外泌体是EVs的一种重要类型，直径< 200 nm的外泌体同属于小细胞外囊泡（small extracellular vesicles,sEVs）一类。外泌体分离的常用方法主要包括超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法和微流控技术等，超速离心法是分离EVs的金标准。

1.2 SC-EVs的生物学功能

干细胞具有多向分化及自我复制的能力，SCEVs可以表现出与亲缘干细胞相近的生物功能，如促进组织细胞增殖分化、细胞迁移、血管神经再生及免疫调节等。在炎症刺激下或组织缺损时，运用干细胞移植进行再生治疗，干细胞分化为不同功能的细胞进行修复，例如心肌细胞、成纤维细胞等。相似情况下，用SC-EVs同样能实现组织器官缺损修复。JARRIGE等[4]认为SC-EVs的作用与SC-EVs的膜性结构特点更易被靶细胞摄取，并通过其包含的各种信息物质miRNA、mRNA进行转录表达。

1.3 SC-EVs骨组织工程

干细胞骨组织工程常用于修复损伤组织或器官，通过将自体或异体的干细胞附着在生物支架上，再移植到组织器官缺损处进行修复，例如在颌骨缺损处放置载有干细胞的3D打印支架进行颌骨修复。在干细胞骨组织工程的基础上，SC-EVs剔除了干细胞载量不足及免疫原性等问题，因而SC-EVs骨组织工程具有更大优势，含SC-EVs的生物材料同样可以实现成骨，如从人第三磨牙中提取的人牙髓干细胞的外泌体，经过物理方式吸附到特定的纳米纤维支架上，修复小鼠颌骨缺损，同时产生新生骨[5]。此外，人牙周膜干细胞[6]、人脐带间充质干细胞[7]以及骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs）[8]等干细胞的EVs植入颌骨后，对靶细胞都具有诱导成骨分化的能力，并且与水凝胶、壳聚糖以及介孔生物活性玻璃等生物材料整合后，能够用于牙槽骨修复。不同的干细胞选择为组织再生的无细胞治疗构建了远大前景。

SC-EVs治疗疾病的另一优势是可以通过加载外源蛋白质或核酸进行工程化改造SC-EVs，增强SC-EVs的结合能力、靶向能力和稳定性，提高疗效[9]；还有种修饰SC-EVs的方法是在初始的干细胞培养阶段对干细胞进行负荷工程处理，诱导SCEVs转录特定分子，使SC-EVs变成高效的药物输送工具，实现肿瘤化疗药物、传染病疫苗和基因治疗药物的精准治疗。

2 牙槽骨改建机制

颌骨骨稳态依赖于成骨细胞和破骨细胞之间的平衡。成骨细胞的主要作用是沉积骨，并通过旁分泌活性因子影响破骨细胞形成。在口腔疾病中，牙周炎和根尖周炎的发生是病理性牙槽骨吸收，而拔牙骨愈合和正畸治疗主要是指生理性骨再生，但两者都涉及炎症反应。牙槽骨吸收始于菌斑的脂多糖或机械刺激释放的促炎因子，刺激组织内的免疫细胞及成骨细胞释放炎性介质，激活巨噬细胞和成纤维细胞，诱导大量的破骨细胞形成和牙槽骨吸收。

促炎因子在骨吸收和骨愈合过程中起着至关重要的作用。在距炎症中心较远处，局部同时进行牙槽骨的修复性再生，发生类骨质及新骨的沉积。研究证实促炎因子通过增强骨髓干细胞、成骨细胞和骨细胞中的RANKL生成来刺激新骨形成[10]，破骨细胞的分化和单核细胞前体的活化均受成骨细胞分泌的RANKL和OPG之间的平衡进行调节。

3 RANKL/RANK/OPG信号通路参与SCEVs促进牙槽骨成骨

3.1 RANKL/RANK/OPG信号通路

RANK是破骨细胞上的Ⅰ型三聚化的跨膜蛋白，是在成骨细胞表面的同聚Ⅱ型跨膜蛋白。RANKL与RANK结合激活静止的破骨细胞，转导到核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信号通路，使NF-κB易位到细胞核中，触发破骨细胞基因转录。

OPG是RANKL的可溶性诱饵受体，OPG与RANK竞争结合RANKL，且OPG与RANKL间更强的亲和力，阻断了破骨细胞分化和激活。在成骨细胞中，RANKL/RANK/OPG通路和Wnt/β-连环蛋白途径相互作用，下调OPG和诱导成骨细胞合成RANKL来控制骨重塑[11]。

RANKL/RANK/OPG信号通路与牙槽骨成骨关系密切。首先，口腔中的牙囊和牙周膜均可表达RANK和RANKL。RANK表达升高可促进成骨细胞发生调节因子Runt相关转录因子2转录，牙槽骨吸收加快，牙齿萌出骨阻力减轻，导致牙齿早萌[12]。RANKL封闭抗体则可阻止RANKL与RANK结合，使骨吸收暂时抑制，导致牙齿迟萌。其次，OPG在口腔牙龈上皮细胞和结缔组织中表达[13]。OZAKI等[14]发现当OPG缺陷小鼠患上牙周炎时，该小鼠的牙周破坏程度进一步加重，此时使用RANKL结合肽便可治疗牙周炎，因为破坏后下颌第一磨牙牙根间隔骨质在结合肽治疗后有了明显成骨现象。同样，在正畸牙齿移动过程中，正畸牙的受压侧和牵张侧的龈沟液中，RANKL、OPG的含量会随正畸力大小产生相应变化。

3.2 SC-EVs与RANKL/RANK/OPG信号通路

SC-EVs通过携带的生物活性成分诱导受体细胞发生信号转导。SC-EVs的作用机制是同时影响受体细胞多个基因和多条信号通路，激活受体细胞的生物功能。针对SC-EVs促进牙槽骨再生修复方面，其机制主要包括以下几种方式：通过上调骨诱导性miRNA和下调骨抑制性miRNA激活PI3K/Akt和MAPK等信号通路从而发挥作用；通过激活蛋白激酶B，影响ERK/AMPK等信号通路；在细胞间高效地递送SC-EVs携带的信号分子，促进RANKL/RANK/OPG信号通路转导。RANKL、RANK与OPG 3者间的比例变化刺激胞内NF-κB经典和非经典途径的骨代谢途径，引起骨代谢发生转换。RANKL/RANK/OPG信号通路对调节骨重建有重要作用，确认SC-EVs通过RANKL/RANK/OPG信号通路促进牙槽骨成骨，也是阐明EVs作用机制的重要切入点。

ALI等[15]研究表明，龈沟液RANKL含量增加或RANKL/OPG比值增高常预示骨量减少，并伴牙槽骨吸收或牙周炎的风险。因此，降低RANKL表达或调节RANKL/OPG比值是预防牙槽骨吸收、辅助成骨的有效策略。在体内，含有RANKL的骨细胞和成骨细胞与含有RANK的破骨细胞往往在空间上距离较远[16]，局部注射SC-EVs可以保证SC-EVs被靶细胞高效摄取并在局部较长时间保留，有利于充分发挥治疗作用[17]。此外，SC-EVs可以在体内模拟亲缘干细胞的归巢效应，这解释了SC-EVs为什么能在骨组织中发生定向迁移，诱导成骨分化。

LIU等[18]研究发现在体外运用BMSCs的sEVs（BMSCs-sEVs）可以促进人牙周膜细胞的迁移、增殖和成骨分化。将BMSC-sEVs与水凝胶整合后注入大鼠牙周炎部位，可以在微型CT下观察到牙槽骨质流失减轻和牙周骨再生的影像；也同时定向检测到实验组大鼠RANKL/OPG比值降低，转化生长因子-β1的表达和2型巨噬细胞与1型巨噬细胞的比例增加。说明BMSCs-sEVs通过RANKL/RANK/OPG信号通路激活破骨细胞的功能，同时通过影响巨噬细胞极化和转化生长因子-β1表达，调节炎症免疫反应，抑制牙周炎的发展和牙周组织的免疫损伤[18]。HUANG等[19]证实脂肪干细胞释放的EVs可以作为骨质疏松症的无细胞治疗剂，其中的2种miRNA：miR-21-5p和let-7b-5p具有减轻骨吸收作用。miR-21-5p是骨诱导性miRNA，可以促进RANKL与OPG结合，因而近来被认为是骨质疏松症的治疗靶点[20]。

牙囊干细胞来源于外胚层间充质，是牙周组织的前体细胞，可分化成牙周膜细胞、成骨细胞及成牙骨质细胞。SHI等[21]发现用脂多糖预处理过的牙囊干细胞释放的sEVs（L-D-sEVs）在治疗牙周炎方面效果显著。不仅治疗初期牙槽骨流失得到修复，治疗后期也能维持一定水平的牙槽骨量。该研究发现运用L-D-sEVs-水凝胶后，牙周组织中RANKL/OPG比值和活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平明显降低，骨质破坏范围更小、骨吸收程度减轻。L-D-sEVs减轻牙槽骨吸收的机制可能与牙周炎组织ROS产生减少有关。因为ROS过度积累会导致细胞氧化损伤，同时ROS介导的JNK信号通路可反向激活RANKL诱导的破骨形成，加重骨流失[22]。类似的研究也证实，牙源性干细胞如牙龈间充质干细胞[23]和根尖牙乳头干细胞[24]等来源的外泌体可以促进牙槽骨再生修复。对正畸治疗和牙周治疗来说，SC-EVs是新的潜在治疗手段。对比其他间充质干细胞，牙源性干细胞来源的SCEVs具有较强的免疫调节、促进组织再生功能。SC-EVs促进牙槽骨骨量不足时的骨改建，增加了正畸牙移动的速率，减轻牙周病骨量流失，为临床医生提供了新思路。

4 问题与展望

SC-EVs治疗方案是牙槽骨组织再生修复的新方向，作为纳米级的无细胞治疗手段，完善了干细胞移植治疗的不足之处，在减轻骨量流失和促进骨修复中都有确切作用。SC-EVs具有较高的生物异质性，但因缺乏更完善的分离和提纯实验指导，以及质量检测手段，在现实的实验操作中存在许多困难，限制了SC-EVs的深入研究和临床转化。当前SC-EVs的应用大多数局限于体外实验和小鼠试验，而大型动物实验开展较少。骨组织工程学是个快速发展的领域，现有骨组织工程支架材料如生物陶瓷材料、聚合物材料及医用金属材料，在修复骨缺损上取得了一定成果。但仍需不断探索能更好满足组织特征、组织孔隙度、良好机械性能和生物相容性及骨诱导能力的个性化复合支架，供日后临床治疗使用。