松鼠大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌混合感染的病原鉴定及诊治

孙 宁，修福晓，李新鸣，张加鑫，郞文萱，徐 澍，俞 曦，周媛婷，荣勤双，孟奕祥，范本旭，曲艺鸣，朱启文

（1.中国刑事警察学院，沈阳，110048；2.沈阳医学院辽宁省行为认知重点实验室，沈阳，110034；3.安徽省铜陵市公安局，铜陵，244000；4.上海市公安局刑事侦查总队警犬队，上海，201799）

近几年，松鼠（Sciurus vulgaris）成为新兴异宠，因其温驯可爱、小巧便携和干净卫生，越来越受欢迎。但由于松鼠人工驯养时间较短，对其品种、饲养条件、行为、疾病防治和健康福利知之甚少［1］。松鼠的临床症状不易被察觉，诊断难度大，患病松鼠来不及治疗会出现急性死亡。d’Ovidio 等［2］调查统计，63% 松鼠会有健康问题，尤其是皮肤病（52%）和肠道疾病（34%）。本文报告1 例松鼠大肠埃希氏菌（Escherichia coli）和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）混合感染的病原鉴定及诊治过程，现将情况汇报如下。

1 临床症状

2021 年12 月，沈阳某学院实验动物中心6 只笼养用于搜索毒品训练的松鼠，初期有1 只突发性死亡，其他松鼠陆续表现为腹泻、食欲减退和精神沉郁等症状，由正常粪便状态（灰黑色，颗粒状或短条状、两端尖）变为软便（不成形，黄色）至水样便（水样，深黄绿色或黑色，恶臭，伴有脓液）（图1）。

图1 发病与病死松鼠的临床症状Fig.1 Clinical symptoms of the sick and dead squirrel

2 病史调查

松鼠为魔王松鼠（Sciurus vulgaris，1758）［3］，购自黑龙江松鼠养殖基地（黑龙江省伊春）。6 只，2 岁，雄性，体质量390～550 g。松鼠在动物中心已人工饲养1年半，每只松鼠单独饲养于78 cm×51 cm×132 cm的3 层大笼中，松鼠的饲料包括榛子、小油葵花子、松子、梨和苹果等。松鼠每日进行搜索毒品训练，每日食物量为85 枚小油葵花子及5 枚榛子或松子，约100 g。饮水洁净。每周喂食红狗营养膏（RedDog）5 g，用以提供21 种维生素和18 种氨基酸均衡营养。

3 剖检结果

将发病死亡松鼠剖检（图2），肛周无残留粪便，解剖后可见胃部胀大、胃内有大量胀气；肠壁变薄，回肠段的肠黏膜充血，盲肠段有胀气，盲肠段肠黏膜呈灰黄色，结肠段肠黏膜呈黑绿色，结肠、直肠内容物几乎无固体粪便，只有大量蛋花状水样便，肠淋巴结肿大出血；肝淤血、肿大；膀胱充盈；其他器官未见明显病变［4-5］。

图2 病死松鼠的剖检结果Fig.2 Autopsy results of the dead squirrel

4 细菌分离鉴定

无菌采集死亡松鼠的粪便、盲结肠内容物及其余5只松鼠的粪便，将标本分别接种5种选择鉴别培养基：血营养琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、沙氏琼脂培养基及甘露醇高盐培养基，对肠道菌进行初次分离培养、2 次分离培养以筛选出不同细菌，3 次分离培养以鉴别肠道菌，最后挑取部分菌落涂于载玻片进行革兰氏染色。

观察菌落特征（图3），血营养琼脂培养基分离培养结果为2 种颜色、形态和大小不同的菌落，并经过血平板2 次分离培养（图4）；伊红美蓝琼脂培养基初次分离培养结果为1 种菌落，菌落中心呈暗蓝黑色，发金属光泽，为大肠埃希氏菌；麦康凯琼脂培养基初次分离培养结果为1 种菌落，菌落呈粉红色，不透明，为大肠埃希氏菌；沙氏琼脂培养基初次分离培养结果为2 种颜色、形态和大小不同的菌落；甘露醇高盐琼脂3次分离培养结果为1种菌落，黄色，不透明，为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或松鼠葡萄球菌（图5）。

图3 初次分离培养结果Fig.3 Results of the first bacterial isolation and culture

图4 血平板2次分离培养结果Fig.4 Results of the second bacterial isolation and culture in the blood agar

图5 甘露醇高盐琼脂3次分离培养结果Fig.5 Results of the third bacterial isolation and culture in the Mannitol salt agar

经过细菌分离形态学鉴定，结合革兰氏染色结果，初步判断为大肠埃希氏菌（可能为致病性菌株）、金黄色葡萄球菌或松鼠葡萄球菌（图6）。

图6 革兰氏染色结果（100×）Fig.6 Gram staining result（100×）

5 细菌16S rDNA基因检测

取菌落培养的平板，按Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒（SK8255）操作抽提DNA。细菌16S rDNA 通用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，预扩增片段长度约为1 500 bp。引物信息见表1。PCR 总反应体系为25.0 µL：正、反引物各1.0 µL，PCR Mix 12.5 µL，ddH2O 9.5 µL，模板1.0 µL。反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃保温。反应结束后，将PCR 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，按照SanPrep 柱式DNAJ 胶回收试剂盒（SK8131）操作，将PCR 产物电泳条带切割所需DNA 目的条带回收，PCR 产物用PCR引物直接测序。

表1 PCR扩增引物信息Tab.1 Primer information

利用特异性引物分别对从粪便、肠道中分离培养的菌株进行PCR 扩增，细菌16S rDNA 基因扩增结果显示得到大小为1 475～1 487 bp的特异性片段，长度与预期相符（图7）。

图7 分离菌16S rDNA基因序列PCR扩增结果Fig.7 Amplification of 16S rDNA of isolated bacteria by PCR

将测定的序列进行BLAST 比对分析，以此来鉴定细菌种属。测序后比对结果显示：分离菌株的基因序列与GenBank 数据库中已上传的LS483305.1等10 种松鼠葡萄球菌参考株相应序列同源性均为100%，与CP072688.1 等10 种大肠埃希氏菌参考株相应序列同源性均为99.93%。由此，综合分离菌的形态学特征、革兰氏染色及16S rDNA 基因测序分析，确定该分离菌为松鼠葡萄球菌和大肠埃希氏菌。

6 大肠埃希氏菌血清型测定

将分离纯化的大肠埃希氏菌进行培养，浓缩菌液，115 ℃高压制成菌体抗原。大肠埃希氏菌O抗原诊断血清购自天津生物芯片技术有限责任公司，按使用说明书进行抗原-抗体平板凝集试验，鉴定本次分离到的大肠埃希氏菌血清型为O2型。

7 药敏试验

采用纸片扩散法进行药敏试验。挑取分离到的单个菌落接种于营养肉汤培养基，37 ℃培养过夜。吸取一定量的菌液涂布于固体培养基，用无菌镊子将14种药敏纸片贴于固体培养基表面，37 ℃培养24 h后观察并测量抑菌圈直径。判定标准：抑菌圈直径（D）≥15 mm为敏感，10 mm≤D＜15 mm为中介，D＜10 mm为耐药。

用于大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌的药敏纸片的种类包括氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、磺胺嘧啶、红霉素、环丙沙星、诺氟沙星、阿米卡星、恩诺沙星、氯霉素、克林霉素（氯洁霉素）和头孢克肟，均购自杭州微生物试剂有限公司。

药敏试验结果显示：大肠埃希氏菌对头孢克肟、庆大霉素和卡那霉素等9 种抗生素敏感，对磺胺嘧啶耐药；松鼠葡萄球菌对头孢克肟、头孢唑啉和氨苄西林等8 种抗生素敏感，对卡那霉素、诺氟沙星、克林霉素和红霉素耐药（表2）。

表2 分离菌株对14种抗菌药物的药敏试验结果Tab.2 The results of drug susceptibility test of isolated strains to 14 antibiotics

8 诊治措施及效果

8.1 药物治疗

如果松鼠粪便为水样，口服头孢克肟颗粒，每日50 mg，兑水，松鼠自行饮用。因头孢克肟具轻微特异臭气味［6］，松鼠嗅觉灵敏，有的松鼠排斥，可将头孢克肟颗粒配合其喜欢的食物喂食，连用3～5 d。如果松鼠粪便为黄软便样，口服乳酸菌素颗粒，每次2 g，2 次/d，兑水或舔服。连用2 d，如果粪便还未成形，立即改为使用头孢克肟颗粒。

8.2 外部消毒

笼子、饮食用具使用次氯酸钠喷洒，消毒1次/d；彻底清理粪便，饮水换为凉白开或纯净水。

8.3 清理残留贮存

在腹泻期间，忌食用油性大的食物，如松子，会影响治疗效果。松鼠有贮存食物习性，平日会将松子埋藏在笼子的角落，需要将松鼠的贮存彻底清理。

经上述综合防治措施，2 d 后未有新发病例，已发病松鼠粪便状态逐渐恢复正常，5 d 后全部恢复正常。

9 讨论

人们越来越意识到微生物群可以反映动物的健康状况，也可以衡量圈养对野生物种生存的影响。细菌感染性疾病不仅与病原微生物有关，还源于微生物群落内常驻菌群的失调［7］。圈养会对野生物种的微生物菌群产生重大影响，减少其丰度并导致菌群失衡。Olah 等［8］研究表明，有30%圈养环境下长大的松鼠，在重置新环境后会发生不明原因死亡，野生和圈养两种不同生活环境下，松鼠的微生物群总体相似，这种微小的差异有利于圈养松鼠。在圈养条件下，松鼠的日粮种类需要接近于野外生活条件的饮食以平衡菌群。野外环境中，松鼠主要取食针叶树种子、榛子、橡子等。当食物资源缺乏时，松鼠也取食蘑菇及其他真菌类食物、鸟类的卵、昆虫、植物的花和嫩芽等［9］。根据松鼠养殖的经验，松鼠在腹泻康复期也可以多食用蘑菇等。

采用分子生物学手段对分离菌16S rDNA 序列进行鉴定很有必要。在细菌基因组中，16S rDNA 基因普遍存在，功能稳定，高度保守，不易发生水平基因转移，已成为细菌分类鉴定的重要分子标记［10］。本报告中松鼠的发病原因确认为大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌混合感染，致病菌混合感染时所引起的临床症状和病理特征既具有广泛性，又具有复杂性，单凭临床观察、病理剖检，甚至细菌培养形态鉴定也难以准确判断致病原。在本试验中，最初认为甘露醇高盐琼脂培养基是金黄色葡萄球菌的选择性培养基［11］，但松鼠葡萄球菌的生化特征在10%NaCl 琼脂上生长良好，对甘露醇发酵反应呈阳性［12］，可见金黄色葡萄球菌和松鼠葡萄球菌的生化特征都耐高盐且能在甘露醇中发酵，因此本研究中分离菌种在甘露醇高盐琼脂培养基的培养结果可能为葡萄球菌属（Staphylococcussp.）中的金黄色葡萄球菌或松鼠葡萄球菌。再通过扩增细菌16S rDNA 基因测序进行鉴定，经BLAST 比对，进一步确定该菌株与GenBank数据库中的松鼠葡萄球菌具有很高的相似性。因此，在传统的细菌形态、生化实验基础上还需要通过16S rDNA 基因序列分析鉴定才能得到精准的鉴定结果。

关于松鼠葡萄球菌的报道不多，松鼠葡萄球菌是最古老的葡萄球菌之一，它一般存在于宠物、野生动物的皮肤和黏膜表面，最早是1976 年由Kloos等［13］报道，从东部灰松鼠（Sciurus carolinensis）、南方鼯鼠（Glaucomys volans）、负鼠（Didelphis virginiana）、浣熊（Procyon lotor）、犬（Canis familiarus）、绵羊（Ovis aries）和人类身上被分离出。Duff 等［14］报道了松鼠在传染痘病毒（Poxviral）后，在眼睛和肠道上继发了松鼠葡萄球菌感染。与金黄色葡萄球菌不同，松鼠葡萄球菌属于凝固酶阴性葡萄球菌，对新生霉素天然耐药，氧化酶反应阳性，这是松鼠葡萄球菌的主要生化特征。作为条件致病菌，在不利因素下，松鼠葡萄球菌可引起心内膜炎、脓毒血症休克和尿路感染，最常见的为伤口感染［15］。

本研究中鉴定的大肠埃希氏菌血清型是O2型，为致病型大肠埃希氏菌。已在鸡、猪、牛和中华竹鼠（Rhizomys sinensis）等多种动物中分离到该型大肠埃希氏菌［16-18］。在3 例松鼠致命性坏死性肠炎病例中发现了溶血型大肠埃希氏菌，同时检测到腺病毒1 型［19］。从英国野外回收的松鼠尸体中鉴定出非溶血型大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌［20］。O2型大肠埃希氏菌临床上引起上述动物的主要症状有腹泻、腹疼、子宫内膜炎和体温升高等，可引起心脏、肾脏和肝脏等多个器官的病变或损伤。

以往研究中，大肠埃希氏菌具有较高的耐药性，尤其是医院分离到的大肠埃希氏菌耐药现象更普遍，主要机制包括超广谱β-内酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）耐药机制、CTX-M基因型耐药机制和AmpC 酶耐药机制［21-23］。本研究分离到的大肠埃希氏菌对头孢克肟、庆大霉素和链霉素等9 种药物具有较高的敏感性，仅对磺胺嘧啶耐药，这与以往研究具有一定差异。这可能是因为松鼠驯化时间短，某些生物特性仍与野生动物具有较高的相似性，如郭定宗等［24］研究表明野生动物的大肠埃希氏菌具有较低的耐药性。从发病鸡体内分离得到的3 株松鼠葡萄球菌对多西环素、阿莫西林和环丙沙星等药物敏感［25］。1 株奶牛源松鼠葡萄球菌的分离菌株对复方新诺明、氨苄西林等7种药物敏感，对克林霉素、头孢噻肟和头孢呋辛中度敏感，对青霉素、红霉素和林可霉素耐药［12］。本研究分离到的松鼠葡萄球菌对头孢克肟、头孢唑啉和氨苄西林等敏感，对卡那霉素、诺氟沙星、克林霉素和红霉素耐药，与上述研究结果略有不同，可见，不同松鼠葡萄球菌菌株对药物有不同程度的敏感性。试验中分离到的大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌均对头孢克肟、链霉素、阿米卡星和恩诺沙星敏感，上述药物可以作为首选临床用药。本病例中首选了松鼠养殖场的常用药——头孢克肟，其对革兰氏阳性菌和阴性菌有广谱抗菌作用［6］。

Olah等［8］在2022年首次报道了健康松鼠的正常菌群微生物群落，包括18 个种和8 个不同属的62 个细菌菌株，无论是野生还是圈养条件下，松鼠发病率最高的都是松鼠葡萄球菌（60%），其次是大肠埃希氏菌（45%）和蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus，35%）。可见，大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌是存在于松鼠等多种宿主体内的病原体。本研究中的病原也为大肠埃希氏菌和松鼠葡萄球菌，可能来源于被细菌污染或变质的食物。松鼠胆小敏感，好躲避人，发病时不易被察觉，且病程短，致死率高，所以在日常中应以预防为主，加强管理，保证食物干净新鲜卫生，严禁饲喂发霉变质饲料，同时对圈舍、饮食器具进行清洁和消毒，保持洁净和干燥，提高松鼠的生活环境质量，预防疫病发生。