内蒙古赤峰地区环境因子对东北马鹿粪便皮质醇的影响

孙 悦，李剑峰，张明海

（1.贵州师范学院生物科学学院，贵阳，550018；2.贵州省高等学校林火生态与管理重点实验室，贵阳，550018；3.贵州省高等学校生物资源开发利用重点实验室，贵阳，550018；4.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040）

肾上腺皮质分泌的糖皮质激素对动物的应激性具有指示作用，其含量常用于动物应激反应的监测［1］。多数哺乳动物糖皮质激素的主要生理活性成分是皮质醇，它能调节机体多项生理功能及影响野生动物行为的表达，因此也经常被作为判断机体对于刺激因素，即应激源的应激反应程度的重要因子［2］。血液激素的测定一直被认为是测定动物生殖激素最直接有效的方法，然而对于野生动物而言，血液样品往往较难获得，因此，基于尿样或粪样监测动物的内分泌指标，在不触及动物的前提下测定个体生理状态，越来越成为准确、实用的新方法［3］。

环境压力是指影响生物体行为和健康的一种状态［4］，其影响可能发生在从分子水平（如糖皮质激素生产）到种群水平（如丰度、年龄结构的变化）等一系列范围内［5］。环境压力主要有3 种类型：第1 种是非生物压力，它来自环境的非生物方面，如温度、降水、海拔和坡度等；第2 种是生物压力，是物种内部或物种之间的相互作用的压力［5］；第3 种，栖息地丧失、狩猎和气候变化等人为干扰压力［5］。面对环境的不确定性，应激反应在使动物应对栖息生境变化和挑战方面起着关键作用［6］。目前一些研究集中在栖息地破碎化和栖息地质量对糖皮质激素的影响上［7］。研究表明［8-9］，人为干扰与糖皮质激素之间存在正相关关系，生活在受干扰栖息地的动物比生活在未受干扰地区的动物具有更高的糖皮质激素水平。为了尽量减少暴露在人为压力源中，野生动物也倾向于将它们的活动模式转变为更多的夜间活动［10］。量化个体健康或生理状态（如糖皮质激素）的指标可为了解人为活动和生境特征如何影响种群动态提供一种主动机制。目前，对于人类活动和栖息地环境因子如何影响马鹿（Cervus elaphus）的粪便皮质醇激素水平知之甚少。

马鹿隶属于哺乳纲（Mammalia）偶蹄目（Artiodactyla）鹿科（Cervidae）鹿属（Cervus），国家二级重点保护野生动物，是栖息在中国东北森林中的典型哺乳动物，在森林生态系统中具有重要的生态地位［11］。本研究基于内蒙古高格斯台罕乌拉国家级自然保护区内不同东北马鹿（C.e.xanthopygus，以下简称“马鹿”）个体粪便中皮质醇水平及栖息地环境因子，分析不同马鹿个体粪便皮质醇代谢产物（faecal cortisol metabolites，FCM）水平，利用多元线性回归模型阐明人为干扰及栖息地环境因子与野生马鹿粪便皮质醇浓度水平之间的关系，探讨栖息地环境因子如何影响马鹿个体粪便皮质醇，以期为保护区野生马鹿的管理政策和保护策略的制定提供理论基础。

1 研究区概况

内蒙古赤峰市高格斯台罕乌拉国家级自然保护区（44°41'3″—45°8'44″ N，119°3'30″—119°39'8″ E）地处中纬度温带半干旱大陆性季风气候区，年平均气温3.8 ℃［11］，总面积1 062.84 km2（图1），属于大兴安岭典型的过渡带森林—草原生态系统，包括森林、灌木、草地和湿地等。

图1 赤峰地区高格斯台罕乌拉国家级自然保护区马鹿研究区Fig.1 The geographic extent of the study area of the red deer in the Gaogesitai Hanwula National Nature Reserve in Chifeng

2 研究方法

2.1 野外数据收集

2019 年12 月—2020 年3 月，根据内蒙古赤峰市高格斯台罕乌拉国家级自然保护区马鹿分布情况，在马鹿分布区域追踪48 h 内的新鲜雪地足迹链，每条足迹链长为2～5 km，发现新鲜的马鹿粪便样本后，记录GPS 点，并用一次性手套收集，每堆新鲜粪便取30 粒样本装在封口袋内，-20 ℃下保存。采用分子生物学方法对收集的82 份新鲜马鹿粪便进行个体识别，确定82 份样品均为马鹿粪便，且均来自不同的个体。

2.2 GIS数据及环境变量

采用对马鹿生境选择有主要影响的环境变量：海拔、坡度、坡向、距森林边缘距离、距道路距离、距村庄距离和归一化植被指数（normalized difference vegetation index，NDVI）。

（1）植被类型：用研究地区1∶50 000林相图进行扫描和矢量化处理，并将研究地区植被景观类型划分为森林、农田、草地和灌丛4种类型。

（2）NDVI：通过地理空间数据云下载。

（3）地形因子：海拔、坡度和坡向以30 m 间隔的等高线为基础，利用ArcGIS 10.2 空间分析功能提取。

（4）道路、河流和村庄根据林相地形图矢量化获得：马鹿活动点到各变量（植被类型、道路和村庄等）的距离由ArcGIS 10.2 中的近邻分析工具计算获得。

2.3 马鹿个体识别

使用QIAamp DNA 粪便试剂盒（QIAGEN，Hilden，Germany）提取马鹿粪便样本中DNA。采用微卫星PCR 技术选取多态性良好的9 对微卫星引物（BM848、BMC1009、BM1225、T123、T501、T530、DM45、BMS1248和ILSTS06）［12］。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，51～60 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 min，40个循环；72 ℃终延伸7 min，4 ℃保存。扩增得到的PCR 产物与loading buffer 混合，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，120 V 电压下电泳约20 min，在凝胶成像系统中初步检测结果［12］。使用Cervus 3.0 对微卫星数据进行分析，完成基因分型。进行基因型比较来确定样品是否来自同一个体。判断同一个体不同样本的原则是：（1）所有位点的基因型相同；（2）在一个位点上只有一个等位基因存在差异［12］。

2.4 激素分析

将粪便样品解冻后，取180～200 g 放入10 mL 离心管中，加入体积为5 mL 的80%甲醇，在60 ℃恒温水浴中涡旋1 min，孵育20 min。上清液以2 500g离心15 min，-20 ℃保存，提取皮质醇。用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法评估粪便样本中的皮质醇浓度，使用含有该激素抗体的非特异性商业试剂盒（CORELISA 试剂盒；上海远屏生物科技有限公司），按说明书操作，皮质醇提取物上清液用稀释液按1∶20 释液，50 µL 稀释提取物用于激素定量。将样品的光密度（OD）与标准曲线进行比较，并在室温下，450 nm处测量样品的OD值。

2.5 统计分析

多元线性回归的基本原理是用最小二乘法对多个自变量之间的关系进行建模。回归模型的多重线性回归模型

式中：Y表示被解释变量；k表示变量个数；β0为回归常数；βi为回归系数（i=1，2，3，…，k）；ε为随机误差项。

使用Minitab 20 数据分析软件（Minitab，LLC，State College，PA，USA），首先对因变量（粪便皮质醇代谢产物浓度）和自变量（距道路距离、距村庄距离、距森林边缘距离、NDVI、坡度、坡向和海拔）通过减去均值再除以标准差的计算方法进行数据标准化处理；采用逆向消元法（删除α=0.05）筛选进入构建模型的自变量，采用方差分析（F检验）对进入模型的自变量构成的回归方程进行显著性检验，如p＜0.05，则回归方程通过了显著性检验，即该回归方程具有统计学意义；采用t检验对构建的回归方程中回归系数进行显著性检验；对进入最终模型的自变量采用多重共线性分析，得出每个因子方差膨胀因子（VIF），如VIF 小于10，表明不存在多重共线性。回归模型的拟合优度采用调整后的R²，是回归方程对因变量的拟合程度。

3 结果

3.1 马鹿粪便皮质醇代谢产物水平

从内蒙古高格斯台罕乌拉国家级自然保护区采集的82份粪便样品中，共鉴定出82个独特的基因型。82只不同马鹿个体粪便样品测定的皮质醇激素水平为2.05～114.3 ng/g，平均水平为（37.56±24.25）ng/g。

3.2 环境应激对马鹿粪便皮质醇代谢产物水平的影响

利用82 只马鹿个体的粪便皮质醇代谢产物水平建立环境变量与激素水平的多元线性回归模型。采用逆向消元法，利用方差分析（F检验），删除距村庄距离、距森林边缘距离、坡度和坡向4 个变量，最终保留对因变量（皮质醇浓度）产生显著影响的变量包括距道路距离、海拔和NDVI。通过表1 可以看出由距道路距离、海拔和NDVI构建的回归模型具有显著性（p＜0.05）。

表1 粪便皮质醇代谢产物的多元线性回归模型方差分析Tab.1 Multivariate linear regression model variance analysis of fecal cortisol metabolites

由多元线性回归模型系数可知，距道路距离、NDVI 和海拔是影响马鹿粪便皮质醇代谢产物水平的主要因子，对3 个变量构建的回归方程的系数进行t检验，3 个变量的系数均显著（p＜0.05），表明解释因变量（皮质醇浓度）具有解释力，同时距道路距离、NDVI 值和海拔3 个变量通过了多重共线性的检验，即方差膨胀因子（VIF）均小于2（表2）。

表2 马鹿粪便皮质醇代谢产物的多元线性回归模型系数Tab.2 Multiple linear regression model coefficients of cortisol metabolites in red deer faeces

构建的最终回归方程调整后的R2解释率为78.08%，模型拟合程度高。Durbin-Watson值为1.1，检验回归分析残差项不存在自相关。模型回归方程为：

FCM=27.5-0.414 6 距道路距离+0.057 97 海拔-165.1NDVI。

在模型的残差分析图（图2）中，正态概率图符合正态分布，在拟合值和序列图中，正态概率图在0 轴上下不规则波动。

图2 马鹿粪便皮质醇代谢产物的多元线性回归统计分析结果Fig.2 Statistical diagnoses of multiple linear regression model for fecal cortisol metabolites of red deer

从马鹿粪便皮质醇代谢产物水平主效应图（图3）进一步可以看出，马鹿粪便皮质醇代谢产物与距道路距离、NDVI值呈负相关，与海拔呈正相关，随着海拔的升高，马鹿粪便皮质醇代谢产物平均值水平呈上升趋势。

图3 马鹿粪便皮质醇代谢产物（FCM）拟合平均值与距道路距离、海拔、NDVI的主效应分析结果Fig.3 The main effect plot analysis of fitted mean hormone fecal cortisol metabolites（FCM）to distance to roads，elevation，and normalized difference vegetation index（NDVI）

通过对马鹿粪便皮质醇代谢产物水平与距道路距离、海拔和NDVI 值之间的等值线图分析得出，马鹿粪便皮质醇代谢产物水平随NDVI值升高而下降，随海拔值升高而上升，随距道路距离值升高先下降后上升（图4）。

图4 粪便皮质醇代谢产物（FCM）与距道路距离、NDVI、海拔三维表面高程Fig.4 Fecal cortisol metabolites（FCM）and distance to roads，normalized difference vegetation index（NDVI），and elevation to village using threedimensional surface

4 讨论

本研究确定了冬季马鹿种群的粪便皮质醇代谢产物水平，并探究影响粪便皮质醇激素水平变化的环境因子。根据目前关于生态应激的研究和全面的理论框架，人为因素是皮质醇激素水平变化的主要驱动力，道路往往通过栖息地丧失或破碎、噪音和直接死亡等方式对陆地野生动物产生负面影响［13］。道路通过改变动物的活动范围、运动、繁殖成功率、逃跑反应和生理状态来改变行为［14］。本研究表明，随着马鹿的活动范围接近道路，马鹿粪便皮质醇代谢产物水平增加，这与Zbyryt 等［15］研究结果一致，表明人为因素（狩猎、道路）与狼（Canis lupus）、猞猁（Lynx lynx）糖皮质激素水平梯度呈正相关。Koemle 等［16］分析了高速公路建设对奥地利马鹿、狍（Capreolus pygargus）和野猪（Sus scrofa）种群的影响，结果表明同一地区的狍和野猪种群数量均随公路密度的增加而减少，而在邻近区域呈上升趋势。海拔高度作为诸多环境因子的综合反映，是影响物种分布的关键性生境因子。海拔对狍生境选择的影响主要表现在海拔为0～500 m 时，海拔越低，狍出现的频率越高，海拔与狍的出现呈负相关；当海拔大于500 m 时，随着海拔的不断升高，狍出现次数也在不断地增加［17］。近年来，NDVI被用于评价生境质量与动物生活史性状之间的关系［18］，大多数食草动物主要依赖于地面植被［19］。Shamon 等［20］建立了与NDVI 和NDVI 斜率（变化速率和方向）相关的有蹄类检测模型，在局部尺度上，一些有蹄类动物选择较高的食物数量，一些有蹄类动物选择较高的食物质量。野生动物物种的长期压力水平可能与食物的可获得性和丰度有关。研究表明灰熊（Ursus arctos）毛发的皮质醇浓度与人为干扰、食物资源可用性和地形条件相关的景观变量有关［21］。

本研究旨在反应马鹿对生境因素及人为干扰环境的生理应激反应。通过收集粪便样本为测量未受干扰的马鹿粪便皮质醇激素浓度和应激反应奠定了基础，有助于识别内蒙古高格斯台罕乌拉国家级自然保护区马鹿栖息地的一些潜在压力来源，观察到的压力空间模式可能与食物的可用性、分布与干扰的特征有关。了解环境因子对马鹿粪便皮质醇的影响可以对野生马鹿的保护和管理工作提供理论依据。