慢性高脂肪饮食对缺血/再灌注大鼠脑损伤影响及机制

李加善 杨德兵 彭志锋

山西大同大学医学院1解剖教研室，2生理教研室（山西大同 037009）

肥胖是缺血性脑卒中的主要危险因素之一［1］。全身炎症是肥胖患者常见病理，并与其他代谢疾病发展有关，如糖尿病、动脉粥样硬化和高血压［2］。现有证据表明，肥胖可通过加重神经炎症和出血而恶化缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）脑损伤［3-5］。然而，在现有研究中，这些相关的分子机制尚未完全阐明。细胞焦亡是程序性细胞死亡新形式。细胞焦亡发生依赖于炎性Caspase和Gasdermin蛋白家族，激活的Caspase-1可使细胞内Gasdermin D蛋白裂解为N端和C端片段；N端Gasdermin D然后在脂质膜上形成一个孔，导致离子失衡、细胞肿胀和细胞凋亡［6］。有研究还表明，焦亡导致损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）大量释放到细胞外，这些分子进一步加重炎症［7-8］。其中高迁移族蛋白B1（high mobility group box-1，HMGB1）属于DAMPs。HMGB1直接与Toll样受体（toll-like receptor，TLR）4结合，并进一步诱导活化B细胞的核因子-κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）活化，从而导致炎症反应扩大［9-10］。但是肥胖是否通过细胞焦亡及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路加重I/R脑损伤仍不明确。因而，本研究旨在评估慢性高脂肪饮食（chronic high-fat diet，HFD）对大鼠脑I/R损伤后细胞焦亡及HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路的影响，有可能为治疗缺血性脑卒中提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组雄性Wistar大鼠（体质量180 ～ 220 g）购于北京维通利华实验动物技术有限公司（动物许可证号：SCXK（京）2019-0011）。它们被安置在温度可控的环境中［（25 ± 1）℃，12 h光周期］。在适应7 d后，按照随机数字表法将大鼠分为正常饮食（normal diet，ND）组（n= 30）和HFD组（n= 30）。每组再分别分为Sham组和I/R组两个亚组，每个亚组15只。正常饮食组以标准饲料饲养，含有碳水化合物495.3 g、脂肪83.7 g、蛋白质269.0 g、维生素65.4 g和纤维34.3 g；HFD组以高脂/高碳水化合物饮食饲养，高脂饮食主要含有碳水化合物190.76 g、脂肪342.24 g、蛋白质353.6 g、胆固醇10 g、维生素85.19 g、DL-蛋氨酸3 g、纤维13.21 g、酵母粉1 g和氯化钠1 g（购于中国医学科学院实验动物研究所）。每周测定食物摄入量和体质量。在16周结束时采集血样以测量代谢参数。I/R手术后24 h，对所有大鼠进行神经行为学评估，然后处死。

1.2 实验试剂HE和尼氏染料（美国Sigma公司）；甘油三酯、总胆固醇和血糖检测试剂盒（天根生物科技有限公司）；NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）、Caspase-1、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、HMGB1、TLR4和NF-κB抗体（美国Sigma公司）。

1.3 大鼠I/R模型制备腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉大鼠。然后在颈部腹面作中线切口显露右侧颈总动脉，用钝性解剖法分离迷走神经附近邻近组织的肌肉，分离颈动脉分叉，仔细分离颈外动脉、颈内动脉、枕动脉和翼腭动脉。将细丝经颈外动脉插入颈内动脉阻断大脑中动脉（middle cerebral artery occlusion，MCAO），阻断60 min后牵拉单丝诱导再灌注，在再灌24 h后进行相关检测。模型成功标志是手术后出现手术侧肢体瘫痪，站立不稳。Sham组除不插入细丝外，其余手术均相同。

1.4 代谢血液参数测定在正常饮食或HFD摄入16周后，从尾静脉收集各组大鼠血液样本。然后将样品在4 ℃下以1 600 ×g离心10 min。根据制造商的说明，使用比色测定法评估甘油三酯、总胆固醇和血糖水平。

1.5 神经行为学测定I/R后24 h，通过使用5点神经缺陷量表来确定神经行为学变化。评分为0，无明显神经功能缺损；1分，无法伸展对侧前爪；2分，向同侧旋转；3分，躯干向对侧倾斜；4分，不能自发或无意识地行走［11］。

1.6 组织病理学测定I/R后24 h，采用经心脏灌注固定处死大鼠。在深度镇静麻醉下，打开胸腔以暴露心脏。接下来，立即通过左心室灌注0.9%生理盐水溶液，以清除循环系统中血液，然后加入4%多聚甲醛用于组织保存。然后收集脑皮层梗死周围区域，并进一步在4%多聚甲醛中固定24 h。随后，将所有样品嵌入石蜡中，并用切片机切成5 μm厚的切片。冠状切片用HE染色，在光学显微镜下观察。

1.7 尼氏染色通过尼氏染色法测定梗死周围区域区神经元的数量。进行5 μm厚的切片，并在37 ℃下用0.5%甲酚紫溶液染色10 min。在光学显微镜下观察神经元形态变化，存活神经元具有完整边界和圆形细胞核，而死亡神经元具有细胞质收缩。测定并比较每组大鼠大脑皮层梗死周围区域活细胞密度。

1.8 蛋白质制备和western blotting分析I/R后24 h，迅速收集脑组织并在冷裂解缓冲液中匀浆。然后，将匀浆在4 ℃下以13 000 r/min离心15 min，收集上清液。通过使用Bradford蛋白质测定法测定总蛋白质浓度。将每个样品中25 μ总蛋白装入10%凝胶中并进行电泳。将分离蛋白质转移到膜上。通过将PVDF膜与5%脱脂牛奶孵育2 h来阻断非特异性蛋白结合。将膜与一级抗体在4 ℃下孵育过夜，主要包括NLRP3、Caspase-1、IL-1β、HMGB1、TLR4和NF-κB抗体。采用TBST洗涤PVDF膜，然后在室温下与抗兔IgG或山羊抗鼠IgG二级抗体孵育2 h。利用化学发光扫描系统检测相关蛋白表达并摄片，采用Quantity one图像分析软件对目标条带吸光度积值进行分析。

1.9 统计学方法采用SPSS 21.0统计软件进行分析，数据以均数±标准差表示。组间比较采用t检验或单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HFD对大鼠代谢影响与ND组相比，HFD组大鼠体质量及内脏脂肪组织重量增加（P＜0.05）；此外，HFD组大鼠血清甘油三酯、总胆固醇和葡萄糖水平均增加（P＜0.05）（表1）。

表1 两组大鼠喂养3个月后代谢参数的比较Tab.1 Comparison of metabolic parameters between two groups of rats after 3 months of feeding ±s

表1 两组大鼠喂养3个月后代谢参数的比较Tab.1 Comparison of metabolic parameters between two groups of rats after 3 months of feeding ±s

组别ND组HFD组t值P值n 30 30体质量（g）398.5 ± 45.3 523.6 ± 61.9 26.437＜ 0.001脂肪组织（g）19.8 ± 23.4 41.2 ± 5.3 39.075＜ 0.001甘油三酯（mg/dL）73.8 ± 7.8 96.7 ± 10.2 14.378 0.006总胆固醇（mg/dL）54.6 ± 5.9 88.6 ± 9.7 31.849＜ 0.001葡萄糖（mg/dL）134.6 ± 16.2 153.8 ± 17.3 11.536 0.017

2.2 HFD对I/R大鼠神经行为学影响无论ND或HFD，I/R组大鼠神经功能缺损评分高于Sham组（P＜0.05）。在I/R组中，HFD大鼠神经功能缺损评分高于ND大鼠（P＜0.05）（表2）。

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较Tab.2 Comparison of neuron function defect scores of rats in each group ±s

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较Tab.2 Comparison of neuron function defect scores of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n t值P值15 15 ND 0 2.8 ± 0.3 46.936＜ 0.001 HFD 0 3.7 ± 0.4 57.423＜ 0.001 9.834 0.028

2.3 HFD对I/R大鼠组织病理学影响在Sham组中，ND大鼠实质组织和细胞排列正常，而HFD大鼠核固缩的萎缩细胞略有增加。在I/R组中，不论ND或HFD大鼠表现为同侧皮层形成大量空泡空间和不规则细胞结构，而且HFD大鼠比ND大鼠具有更多的受损细胞（图1）。

图1 各组大鼠典型HE染色（× 40）Fig.1 Typical HE staining of rats in each group（× 40）

2.4 HFD对I/R大鼠神经元存活影响在Sham组中，ND和HFD大鼠尼氏阳性细胞在大脑中广泛表达。在I/R组中，ND和HFD大鼠同侧皮层神经元细胞质收缩和核固缩（图2）。与Sham组相比，I/R大鼠大脑皮层存活神经元减少（P＜0.05），而且HFD大鼠存活神经元数量少于ND大鼠（P＜0.05）（表3）。

图2 各组大鼠典型尼氏染色（× 40）Fig.2 Typical Nissl staining of rats in each group（× 40）

表3 各组大鼠存活神经元密度比较Tab.3 Comparison of survival neuron density of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n5 5 t值4.784 8.173 P值0.107 0.025 ND 100.0 ± 0.0 37.3 ± 4.2 63.740＜ 0.001 HFD 93.5 ± 9.6 20.6 ± 2.4 75.382＜ 0.001

2.5 HFD对I/R大鼠细胞焦亡相关蛋白影响与Sham组相比，I/R组中ND和HFD大鼠细胞焦亡相关蛋白（NLRP3、Caspase-1、IL-1β）表达增加（P＜0.05），而且HFD大鼠细胞焦亡相关蛋白（NLRP3、Caspase-1、IL-1β）表达高于ND大鼠（P＜0.05）（图3和表4-6）。

图3 各组大鼠典型细胞凋亡相关蛋白的表达Fig.3 Expression of typical apoptosis related proteins of rats in each group

表4 各组大鼠NLRP3蛋白表达的比较Tab.4 Comparison of NLRP3 protein expression of rats in each group ±s

表4 各组大鼠NLRP3蛋白表达的比较Tab.4 Comparison of NLRP3 protein expression of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 175.3 ± 18.6 9.164 0.012 HFD 105.8 ± 11.2 227.6 ± 24.4 14.826＜ 0.001 t值1.946 7.139 P值0.832 0.036

表5 各组大鼠Caspase-1蛋白表达的比较Tab.5 Comparison of Caspase-1 protein expression of rats in each group ±s

表5 各组大鼠Caspase-1蛋白表达的比较Tab.5 Comparison of Caspase-1 protein expression of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 198.3 ± 20.1 13.836＜ 0.001 HFD 103.6 ± 11.3 247.6 ± 25.0 17.649＜ 0.001 t值1.238 6.972 P值0.896 0.039

表6 各组大鼠IL-1β蛋白表达的比较Tab.6 Comparison of IL-1β protein expression of rats in each group ±s

表6 各组大鼠IL-1β蛋白表达的比较Tab.6 Comparison of IL-1β protein expression of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n5 5 t值2.182 6.549 P值0.814 0.041 ND 100.0 ± 0.0 203.3 ± 21.1 17.378＜ 0.001 HFD 108.5 ± 11.7 268.1 ± 28.4 23.538＜ 0.001

2.6 HFD对I/R大鼠HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路影响与Sham组相比，I/R组中ND和HFD大鼠HMGB1及其下游因子TLR4和NF-κB表达增加（P＜0.05），而且HFD大鼠HMGB1及其下游因子TLR4和NF-κB表达高于ND大鼠（P＜0.05）（图4和表7-9）。

图4 各组大鼠典型HMGB1/TLR4/NF-κB蛋白的表达Fig.4 Expression of typical HMGB1/TLR4/NF-κB protein of rats in each group

表7 各组大鼠HMGB1蛋白表达的比较Tab.7 Comparison of HMGB1 protein expression of rats in each group ±s

表7 各组大鼠HMGB1蛋白表达的比较Tab.7 Comparison of HMGB1 protein expression of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 217.3 ± 22.8 24.4280＜ 0.001 HFD 101.5 ± 10.6 300.2 ± 32.4 68.354＜ 0.001 t值0.084 9.152 P值0.969 0.013

表8 各组大鼠TLR4蛋白表达的比较Tab.8 Comparison of TLR4 protein expression of rats in each group ±s

表8 各组大鼠TLR4蛋白表达的比较Tab.8 Comparison of TLR4 protein expression of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 207.3 ± 21.4 22.638＜ 0.001 HFD 95.5 ± 9.8 310.3 ± 32.0 74.736＜ 0.001 t值1.043 9.376 P值0.925 0.011

表9 各组大鼠NF-κB蛋白表达的比较Tab.9 Comparison of NF-κB protein expression of rats in each group ±s

表9 各组大鼠NF-κB蛋白表达的比较Tab.9 Comparison of NF-κB protein expression of rats in each group ±s

组别Sham组I/R组t值P值n5 5 ND 100.0 ± 0.0 175.2 ± 19.6 9.543 0.010 HFD 101.4 ± 9.8 283.1 ± 29.0 52.457＜ 0.001 t值0.028 11.649 P值0.987 0.006

3 讨论

本研究主要观察HFD摄入对I/R大鼠脑损伤影响，以及细胞焦亡和HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路在其中的作用。研究结果表明，HFD摄入恶化了I/R大鼠神经功能预后，并降低了神经元存活率。值得注意的是，本研究结果首次表明，在HFD喂养大鼠脑I/R损伤中，细胞焦亡和HMGB1信号通路显著增强。

给大鼠喂养HFD，持续16周，这种饮食模式已被广泛报道会诱发多种代谢疾病，如非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化，以及肾、肠、脑和胰腺损伤［12-14］。与我们的数据一致，尽管ND组和HFD组大鼠食物摄入量没有区别，但HFD组大鼠体质量、内脏脂肪以及血清甘油三酯、总胆固醇和葡萄糖水平均增高。这些参数证实了HFD摄入大鼠存在与肥胖相关的代谢障碍。之后我们探讨了HFD摄入对短暂MCAO引起的I/R大鼠脑损伤的影响。在I/R组中，与ND大鼠相比，HFD大鼠神经功能缺损评分增高。这些数据表明，HFD摄入加剧了I/R大鼠脑损伤严重程度。我们还通过HE染色观察了各组大鼠同侧大脑皮层组织病理学变化。在I/R组中，HFD大鼠比ND大鼠具有更多的受损细胞。这一发现与尼氏染色测定的存活神经元密度一致。在I/R组中，具有清晰边界且无细胞质收缩的完整神经元数量减少。在两种饮食之间进行比较，与ND大鼠相比，HFD大鼠存活神经元减少更多。这些数据表明，HFD会促进神经元死亡，从而导致I/R损伤后大脑功能紊乱。

凋亡和坏死这两种类型的细胞死亡都可以被调节，每种类型都有不同的形态学和生化特征［15-17］。细胞焦亡也被归为程序性坏死形式。尽管细胞焦亡受信号通路调节，但细胞焦亡发生均需要质膜破裂，这种现象会导致细胞内物质排出到细胞外，进而引发炎症反应［18-19］。目前，抑制这些信号通路被视为缺血性脑卒中一种有前途的治疗方法。例如，给予MCC-950（NLRP3炎性体特异性抑制剂），可有效减少炎性信号和脑水肿，从而改善I/R大鼠脑梗死体积和神经功能［20］。这一证据支持细胞焦亡参与I/R大鼠脑损伤。因此，我们探讨了HFD喂养大鼠I/R损伤后细胞焦亡的作用。结果显示，在HFD喂养I/R大鼠中，与细胞焦亡相关蛋白质（NLRP3、caspase-1和IL-1β）在脑梗死周围显著增加。这些结果表明，长期食用HFD会加剧I/R大鼠细胞焦亡。如上所述，细胞焦亡通过调节细胞脂质膜双层中孔形成来诱导溶解性细胞死亡。从而导致DAMPs释放到细胞外空间。HMGB1是一种常见DAMPs，参与脑I/R损伤后炎症信号启动和传播［21］。该分子介导TLR4/NF-κB信号通路，是缺血大脑促炎症中起重要作用介质［22-23］。TLR4/NF-κB级联激活对I/R脑损伤产生有害影响，而抑制这些信号传导可减少脑梗死［24］。此外，NF-κB还调节NLRP3表达，NLRP3是炎症复合体主要成分；这种调节会导致细胞焦亡［25］。因此，我们进一步研究脑I/R损伤后HMGB1、TLR4和NF-κB信号蛋白表达。在I/R组中，与ND大鼠相比，HFD大鼠HMGB1、TLR4和NF-κB表达增高。因此，HFD加剧I/R损伤后HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路。下一步研究需采用上述信号通路特异性抑制剂来确认该信号通路在细胞焦亡中具体作用。

总之，本研究结果表明，HFD摄入会加重大鼠脑I/R损伤后细胞焦亡，并增强HMGB1/TLR4/NFκB信号通路表达，从而导致I/R后不良结局。