扁蒴藤素调节ROS/ASK1/JNK信号通路对二乙基亚硝胺诱导大鼠肝癌的抑制作用

刘燕 张冬华 黄渝茜 刘有顺 黄骥

1赣南卫生健康职业学院医学基础部解剖与组胚教研室（江西赣州 341000）；2赣州市人民医院（江西赣州 341000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最致命的癌症之一，与肝硬化和纤维化密切相关，发展中国家的HCC病死率和发病率更高，肝癌在初始阶段通常无症状，通常在晚期才能诊断出来，这使得手术成功变得更加困难［1］。HCC的治疗策略包括化疗、放疗、手术和免疫治疗。然而，这些治疗中的大多数都伴随着严重的副作用和复发。现在急需开发一种新型抗癌药物，能够提高治疗效果［2］。二乙基亚硝胺（diethylnitrosamine，DEN）是一种强致癌的二烷基亚硝胺，存在于烟草烟雾、切达干酪、肉类和威士忌中。DEN代谢过程中产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可能在癌症发展中起重要作用［3］。扁蒴藤素（pristimeri，Pris）是一种从卫矛科和海马科植物中分离出来的天然生物活性成分，EL-AGAMY等［4］发现，Pris可以作为抗自身免疫性肝炎的新型保肝剂。Pris还具有抗肿瘤作用，Pris可以通过诱导细胞凋亡缓解HCC［5］。ROS/ASK1/JNK信号轴是癌症研究的常见通路，研究发现［6］，激活ROS/ASK1/JNK途径可以诱导非小细胞肺癌凋亡。ZHAO等［7］发现Pris激活ROS/ASK1/JNK途径诱导细胞凋亡和自噬抑制乳腺癌的发生。近期，LI等［8］发现激活ROS/ASK1/JNK信号轴可以激活氧化应激缓解HCC。本研究旨在探究Pris是否可以通过激活ROS/ASK1/JNK信号轴促进细胞凋亡和氧化应激进而抑制HCC。

1 材料与方法

1.1 动物SPF级雄性SD大鼠（200 ～ 220 g）（许可证号：SCXK（浙）2022-0005）购自杭州启真实验动物科技有限公司，12 h的光/暗交替进行，自由采食和饮水，温度设置为23 ～ 27 ℃，相对湿度为40% ～ 65%。实验方案获得本院动物伦理委员会批准（编号：2023J0017）。

1.2 主要试剂Pris、谷胱甘肽还原酶（GR）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）试剂盒购自上海晶抗生物工程有限公司；ROS/ASK1/JNK信号通路抑制剂Vaccarin购自MedChemExpress LLC；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、乳酸脱氢酶（LDH）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；白介素6（IL-6）试剂盒、单核细胞趋化蛋白-1（CCL2）试剂盒武汉华美生物工程有限公司；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、谷草转氨酶（AST）试剂盒购自上海酶研生物科技有限公司；Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3、p-ASK1、ASK1、p-JNK、JNK抗体均购自Abcam。ROS试剂盒购自上海彩佑实业有限公司。

1.3 模型制备及分组随机选择6只大鼠作为对照组，其余大鼠参照先前文献［9］造模，首先按照200 mg/kg的剂量通过腹腔注射DEN，每周1次，连续注射16周诱导HCC大鼠模型，随机选择3只大鼠进行HE染色。根据肝脏病理变化判断是否造模成功。将造模成功大鼠随机平分为HCC组、Pris组、Vaccarin组、Pris + Vaccarin组，每组均6只大鼠。Pris组参考先前文献［4］通过腹腔注射0.8 mg/kg的Pris，连续注射1周；Vaccarin组参考先前文献［10］通过腹腔注射100 mg/kg ROS/ASK1/JNK信号通路抑制剂Vaccarin，连续注射一周；Pris + Vaccarin组在注射0.8 mg/kg的Pris的基础上注射100 mg/kg-Vaccarin，连续注射1周。HCC组和对照组注射等量生理盐水。

1.4 测量体质量、肝质量以及样本采集药物治疗结束24 h用电子称测量大鼠体质量，随后将大鼠麻醉，用采血针通过腹主动脉采取5 mL血液通过离心机4 000转，离心8 min后获取上清液，保存在-20 ℃用于ELISA试剂盒检测。将大鼠处死解剖后取肝组织样本称量质量后，一部分固定在4%多聚甲醛用于病理变化观察，一部分保存在-80 ℃用于Western blot检测和ELISA检测。肝脏体质量比=（肝脏质量/体质量）× 100%。

1.5 ELISA法检测肝功能、炎性因子、抗氧化指标采用ELISA试剂盒检测血清IL-6、TNF-α、CCL-2、SOD、GR、GPx、CAT、ROS含量，以及肝脏组织ALT、AST、ALP、LDH水平。

1.6 HE染色检测肝脏病理变化取上述4%多聚甲醛固定的肝脏组织用乙醇脱水后包埋在石蜡中，切成4 ～ 5 μm的石蜡切片，用苏木精和伊红（H&E）染色。最后用中性树胶封片，用显微镜观察肝脏病理变化。

1.7 Western blot检测细胞凋亡标志物（Bax、Bcl-2和cleaved-Caspase-3）以及ROS/ASK1/JNK信号通路蛋白表达使用RIPA裂解缓冲液提取肝脏组织的总蛋白，蛋白质浓度通过BCA蛋白质测定试剂盒定量，将等量蛋白质通过SDS-PAGE电泳分离后转到PVDF膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭膜，在4 ℃与下列一抗孵育一夜：Bax（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、cleaved-Caspase-3（1∶1 000）、ASK1（1∶2 000）、JNK（1∶2 000）、p-ASK1（1∶2 000）、p-JNK（1∶2 000）和GAPDH抗体（1∶1 000），TBST洗涤后，加入二抗，加ECL显色，凝胶成像系统观察目的条带，目的条带使用Image J软件进行半定量。

1.8 统计学方法数据均用SPSS 25软件处理，数据在进行正态分布和方差齐性检验后以平均值±标准差表示，单因素方差分析比较多组间差异，SNK-q检验比较两组间差异。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Pris对大鼠体质量、肝脏质量以及肝脏体质量比的影响与对照组相比，HCC组体质量显著下降，差异有统计学意义（P＜ 0.05），肝脏质量、肝脏体质量比显著增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与HCC组相比，Pris组体质量显著升高，差异有统计学意义（P＜ 0.05），肝脏质量、肝脏体质量比显著降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05），而Vaccarin组趋势相反；与Pris组相比，Pris+Vaccarin组体质量显著下降，差异有统计学意义（P＜ 0.05），肝脏质量、肝脏体质量比显著上升，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 各组大鼠体质量、肝脏质量以及肝脏体质量比的比较Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，and liver weight ratio of rats in each group ±s，n = 6

表1 各组大鼠体质量、肝脏质量以及肝脏体质量比的比较Tab.1 Comparison of body weight，liver weight，and liver weight ratio of rats in each group ±s，n = 6

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与HCC组比较，bP ＜ 0.05；与Pris组比较，cP ＜ 0.05

肝脏体质量比（%）3.04 ± 0.24 8.31 ± 0.63a 3.42 ± 0.27b 17.32 ± 1.25b 7.20 ± 0.61c 296.136＜ 0.001组别对照组HCC组Pris组Vaccarin组Pris+Vaccarin组F值P值体质量（g）410.28 ± 55.34 281.14 ± 33.54a 389.21 ± 46.83b 200.45 ± 24.37b 298.16 ± 35.36c 26.566＜ 0.001肝脏质量（g）12.49 ± 1.28 23.35 ± 2.14a 13.34 ± 1.26b 34.73 ± 3.05b 21.46 ± 2.14c 112.499＜ 0.001

2.2 Pris对大鼠肝功能的影响与对照组相比，HCC组ALT、AST、ALP、LDH含量显著增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与HCC组相比，Pris组ALT、AST、ALP、LDH含量显著降低，差异有统计学意义（P＜ 0.05），而Vaccarin组与Pris组趋势相反；与Pris组相比，Pris+Vaccarin组ALT、AST、ALP、LDH含量显著上升，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表2。

表2 Pris对大鼠ALT、AST、ALP、LDH含量的影响Tab.2 Effect of Pris on the contents of ALT，AST，ALP，and LDH in rats ±s，n = 6

表2 Pris对大鼠ALT、AST、ALP、LDH含量的影响Tab.2 Effect of Pris on the contents of ALT，AST，ALP，and LDH in rats ±s，n = 6

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与HCC组比较，bP ＜ 0.05；与Pris组比较，cP ＜ 0.05

组别对照组HCC组Pris组Vaccarin组Pris+Vaccarin组F值P值LDH（U/mL）311.57 ± 36.18 591.08 ± 63.12a 421.44 ± 45.16b 930.61 ± 95.07b 501.17 ± 53.12c 86.871＜ 0.001 ALT（U/mL）105.35 ± 11.82 279.58 ± 30.97a 134.57 ± 21.57b 416.46 ± 54.64b 210.21 ± 21.13c 93.460＜ 0.001 AST（U/mL）136.23 ± 18.64 354.14 ± 40.42a 186.07 ± 20.63b 532.48 ± 57.26b 304.57 ± 38.43c 101.324＜ 0.001 ALP（U/mL）140.89 ± 17.09 313.43 ± 38.46a 191.34 ± 20.11b 436.56 ± 49.69b 283.01 ± 30.32c 70.912＜ 0.001

2.3 Pris对大鼠炎性因子、抗氧化指标的影响与对照组相比，HCC组IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量显著增加，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与HCC组相比，Pris组IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量显著下降，差异有统计学意义（P＜ 0.05），而Vaccarin组结果相反；与Pris组相比，Pris+Vaccarin组IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx和CAT含量显著上升，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表3、4。

表3 Pris对大鼠IL-6、TNF-α、CCL-2含量的影响Tab.3 Effects of Pris on IL-6，TNF-α，and CCL-2 contents in rats ±s，n = 6

表3 Pris对大鼠IL-6、TNF-α、CCL-2含量的影响Tab.3 Effects of Pris on IL-6，TNF-α，and CCL-2 contents in rats ±s，n = 6

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与HCC组比较，bP ＜ 0.05；与Pris组比较，cP ＜ 0.05

TNF-α（pg/mL）0.76 ± 0.10 3.47 ± 0.44a 1.27 ± 0.16b 6.57 ± 0.68b 3.00 ± 0.35c 193.237＜ 0.001组别对照组HCC组Pris组Vaccarin组Pris+Vaccarin组F值P值CCL-2（pg/mL）103.64 ± 14.15 251.35 ± 25.37a 123.98 ± 13.26b 368.48 ± 47.58b 205.24 ± 24.24c 88.266＜ 0.001 IL-6（pg/mL）22.32 ± 2.73 54.34 ± 5.54a 33.59 ± 3.37b 69.57 ± 6.37b 49.34 ± 4.29c 93.392＜ 0.001

表4 Pris对大鼠SOD、GR、GPx和CAT含量的影响Tab.4 Effect of Pris on SOD，GR，GPx，and CAT contents in rats ±s，n = 6

表4 Pris对大鼠SOD、GR、GPx和CAT含量的影响Tab.4 Effect of Pris on SOD，GR，GPx，and CAT contents in rats ±s，n = 6

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与HCC组比较，bP ＜ 0.05；与Pris组比较，cP ＜ 0.05

组别对照组HCC组Pris组Vaccarin组Pris+Vaccarin组F值P值CAT（U/mL）31.14 ± 2.42 46.23 ± 6.64a 33.07 ± 4.63b 61.48 ± 7.26b 43.57 ± 4.43c 84.278＜ 0.001 SOD（U/mL）14.35 ± 2.37 23.64 ± 3.15a 16.48 ± 1.58b 33.98 ± 5.26b 19.24 ± 2.04c 15.618＜ 0.001 GR（U/mL）16.35 ± 1.63 28.78 ± 2.91a 18.21 ± 1.78b 37.45 ± 4.75b 24.67 ± 2.56c 72.724＜ 0.001 GPx（U/mL）9.58 ± 0.97 15.35 ± 1.82a 10.46 ± 1.24b 34.57 ± 4.57b 13.21 ± 1.56c 84.278＜ 0.001

2.4 Pris对大鼠肝脏病理变化的影响对照组大鼠表现出正常的肝脏组织结构；HCC组可以观察到部分肝细胞坏死，出现局灶性结节性增生现象；Pris组改善了肝细胞坏死以及局灶性结节性增生现象，而Vaccarin组出现大片肝细胞坏死，细胞体积增大；Pris+Vaccarin组与HCC组结构相似，见图1。

图1 各组大鼠肝脏病理变化（× 200）Fig.1 Pathological changes in liver of rats in each group（× 200）

2.5 Pris对大鼠凋亡标志蛋白的影响与对照组相比，HCC组Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著下调（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平显著上调，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与HCC组相比，Pris组Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著上调，差异有统计学意义（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平显著下调，差异有统计学意义（P＜ 0.05），而Vaccarin组与Pris组蛋白水平相反；与Pris组相比，Pris+Vaccarin组Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著下降，差异有统计学意义（P＜ 0.05），Bcl-2蛋白水平显著上升，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见图2，表5。

图2 Western blot法检测凋亡标志蛋白水平Fig.2 Western blot method for detecting the level of apoptosis marker protein

表5 Pris对大鼠Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3蛋白水平的影响Tab.5 Effect of Pris on Bax，Bcl-2，and cleaved-Caspase-3 protein levels in rats ±s，n = 6

表5 Pris对大鼠Bax、Bcl-2、cleaved-Caspase-3蛋白水平的影响Tab.5 Effect of Pris on Bax，Bcl-2，and cleaved-Caspase-3 protein levels in rats ±s，n = 6

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与HCC组比较，bP ＜ 0.05；与Pris组比较，cP ＜ 0.05

cleaved-Caspase-3/GAPDH 1.37 ± 0.16 0.96 ± 0.10a 1.31 ± 0.14b 0.48 ± 0.05b 1.00 ± 0.12c 80.433＜ 0.001组别Bax/GAPDH Bcl-2/GAPDH对照组HCC组Pris组Vaccarin组Pris+Vaccarin组F值P值1.26 ± 0.13 0.68 ± 0.05a 1.13 ± 0.09b 0.39 ± 0.02b 0.71 ± 0.06c 120.314＜ 0.001 0.74 ± 0.08 1.33 ± 0.15a 0.89 ± 0.17b 1.82 ± 0.09b 1.30 ± 0.15c 55.055＜ 0.001

2.6 Pris对大鼠ROS及ROS/ASK1/JNK信号通路蛋白水平的影响与对照组相比，HCC组ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与HCC组相比，Pris组ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05），而Vaccarin组ROS、ASK1、JNK水平显著下降；与Pris组相比，Pris+Vaccarin组ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3、4，表6。

图3 Western blot法检测ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平Fig.3 Western blot method for detecting ROS/ASK1/JNK pathway protein levels

表6 Pris对大鼠ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平的影响Table 6 Effect of Pris on ROS/ASK1/JNK pathway protein levels in rats ±s，n = 6

表6 Pris对大鼠ROS/ASK1/JNK通路蛋白水平的影响Table 6 Effect of Pris on ROS/ASK1/JNK pathway protein levels in rats ±s，n = 6

注：与对照组比较，aP ＜ 0.05；与HCC组比较，bP ＜ 0.05；与Pris组比较，cP ＜ 0.05

p-JNK/JNK 0.78 ± 0.09 0.44 ± 0.05a 0.72 ± 0.09b 0.27 ± 0.04b 0.50 ± 0.06c 54.753＜ 0.001组别对照组HCC组Pris组Vaccarin组Pris+Vaccarin组F值P值ROS（mg/mL）25.00 ± 2.89 10.66 ± 1.05a 21.91 ± 2.07b 5.34 ± 0.52b 13.70 ± 1.46c 116.200＜ 0.001 p-ASK1/ASK1 0.95 ± 0.05 0.52 ± 0.04a 0.83 ± 0.07b 0.38 ± 0.03b 0.66 ± 0.05c 158.283＜ 0.001

3 讨论

HCC是肝细胞的原发性恶性肿瘤，根据美国国家癌症研究所的SEER数据库，美国HCC患者的平均5年生存率为19.6%，但晚期转移性患者生存率可低至2.5%。当在早期阶段确诊时，可以进行局部治疗，包括手术切除、射频消融、经动脉化疗栓塞或肝移植。然而，HCC通常在肿瘤不可切除的晚期被诊断出来，使得这些治疗无效［11-12］。DEN是一种成熟的肝癌物质，它会引发肝损伤，并经常用于在动物模型中引发肝癌发生［13］。据报道［14］，DEN诱导肝癌发生的病理过程与人类肝癌更相似。因此，DEN诱导的肝癌动物模型被广泛用于肝癌研究。本研究通过注射DEN构建HCC大鼠模型，HE染色结果显示，对照组大鼠表现出正常的肝脏组织结构；HCC组可以观察到部分肝细胞坏死，出现局灶性结节性增生现象，提示HCC大鼠造模成功。Pris可以通过影响细胞凋亡、自噬、迁移、侵袭、血管生成等肿瘤相关过程起到抗癌作用［15］。近期研究［5］发现，Pris可以通过抑制细胞活力、迁移和血管生成，促进细胞凋亡来抑制HCC发展。在本研究中，HCC组较对照组大鼠体质量显著下降，肝脏质量、肝脏体质量比显著升高，而Pris处理改善了肝细胞坏死以及局灶性结节性增生现象，Pris组较HCC组体质量显著升高，肝脏质量、肝脏体质量比显著下降，表明Pris可以对HCC大鼠产生积极影响。

细胞凋亡和氧化应激在HCC发展过程中起重要作用。Bcl-2、Bax及cleaved-Caspase-3是参与细胞凋亡调节的关键蛋白［16-18］。而氧化应激抑制HCC的发生［19］。AST、ALT、ALP、LDH可用作诊断化学物质和药物引发的肝功能改变的生物标志物［20］。研究报道称，DEN诱导的HCC大鼠血清AST、ALT、ALP、LDH水平显著升高［21］。KUMAR等［22］发现，HCC大鼠体内IL-6、TNF-α水平显著升高，加重了炎症反应。本研究结果与先前研究一致显示，HCC组较对照组Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平显著下降，ALT、AST、ALP、LDH含量、IL-6、TNF-α、CCL-2含量、SOD、GR、GPx、CAT含量、Bcl-2蛋白水平显著增加，表明DEN处理后大鼠炎症反应升高、肝损伤加重，细胞凋亡较低。而Pris治疗后促进了氧化应激及细胞凋亡，减轻了肝损伤，从而抑制HCC。

通过调控ROS/ASK1/JNK信号轴促进细胞凋亡，进而抑制癌症的发展已多有报道。例如，MHONE等［23］发现激活ROS/ASK1/JNK信号轴可以诱导细胞凋亡，进而抑制肺腺癌的发生。且已有研究［8］发现，Pris可以通过激活ROS/ASK1/JNK信号轴诱导细胞凋亡制乳腺癌的发展。本研究发现，HCC组较对照组ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平显著下降，而Pris治疗后ROS、p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK水平显著升高，提示Pris可能通过激活ROS/ASK1/JNK信号轴抑制HCC的发生，为了进一步证实该结论，我们用ROS/ASK1/JNK信号轴抑制剂Vaccarin处理HCC大鼠，结果发现，Vaccarin逆转了Pris对HCC大鼠的抗癌效果。

综上所述，Pris可能通过上调ROS/ASK1/JNK信号通路促进氧化应激及细胞凋亡，进而改善HCC大鼠肝损伤。本文的新颖之处是首次研究了ROS/ASK1/JNK信号轴在HCC上的影响，进一步研究了Pris在HCC上的作用机制，本研究为治疗HCC提供实验参考数据以及潜在治疗药物。本文不足时，缺少对Pris治疗的最适剂量的探究以及Pris是否可以调控其它通路起到相同效果，这将是后续研究的方向。