连接蛋白43在氧化低密度脂蛋白诱导RAW264.7细胞自噬中的作用

熊思渊 王璐 田俊杰 谷扬 马雅静 马克涛 张莹莹1，3， 李新芝

1新疆地方与民族高发病教育部重点实验室（新疆石河子 832000）；2国家卫健委中亚高发病防治重点实验室（新疆石河子 832000）；石河子大学医学院3生理学教研室，4病理生理学教研室（新疆石河子 832000）；5石河子大学医学院第一附属医院检验科（新疆石河子 832000）

心脑血管疾病是造成全球人类发病和死亡的主要原因。目前，动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）被认为是引起心血管疾病的主要病因［1］。AS斑块不稳定、破裂是导致临床急性心血管事件的主要原因，而巨噬细胞在AS斑块的起始、生长和最终破裂过程中发挥核心作用。故以巨噬细胞为研究对象，深入探究其在AS的发生发展过程中的作用是至关重要的。前有研究表明，在AS斑块形成过程中，单核细胞进入血管壁下内皮，转化为巨噬细胞，巨噬细胞吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）或其他修饰脂蛋白后转化为泡沫细胞，此过程会促使巨噬细胞释放大量细胞因子，刺激血管中膜平滑肌细胞增殖，加速AS发展［2］。据报道，ox-LDL、缺氧、活性氧等因素可诱导细胞自噬［3］。自噬是一种细胞依赖溶酶体进行自我保护的分解代谢途径，该过程能维护细胞内环境稳定［4］。自噬能对细胞起到保护及抗氧化应激、降低细胞凋亡的作用。此外，巨噬细胞自噬能减少泡沫细胞的积累，增强AS斑块稳定性，从而抑制斑块的形成和发展［3，5］。

缝隙连接蛋白（connexin，Cx）是构成细胞间缝隙连接的关键蛋白，其能在细胞间进行信号转导，构建细胞与细胞之间的联系，且连接蛋白形成的半通道和缝隙连接通道在AS的发展中也起着重要的作用。大量研究表明，Cx43在AS发展过程中起到关键作用。前有学者提出，Cx43能增强巨噬细胞迁移能力，参与调节巨噬细胞极化，且细胞自噬过程伴随着Cx43表达变化［6］，提示Cx43可能通过影响巨噬细胞自噬参与AS的发生发展。所以，为了明确Cx43是否参与巨噬细胞自噬过程，从而影响AS的发生与发展，本研究通过ox-LDL构建巨噬细胞自噬及泡沫化模型，再应用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光技术检测Cx43特异性阻断剂Gap26及Gap19对RAW264.7细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B表达。本研究的创新之处在于探究Cx43在ox-LDL诱导RAW264.7自噬中的作用，为临床上以Cx43为靶向治疗AS提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器RAW264.7小鼠单核巨噬细胞系购自武汉普诺赛公司，CO2恒温培养箱为美国Thermo Fisher Scientific公司；CFX96 Touch荧光定量PCR检测系统为美国Bio-Rad公司；凝胶图像成像仪为美国BIO-RAD公司；非接触式激光共聚焦显微镜（LSM510）为德国CarlZeiss公司。ox-LDL购自中国广州亦源公司；Anti-Cx43抗体、Anti-Beclin1抗体、Anti-LC3B抗体均购自美国Abcam公司；小鼠抗β-actin单抗、小鼠抗GAPDH单抗、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG/FITC标记二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG/FITC标记二抗均购自于中国北京中杉金桥生物技术有限公司；上下游引物购自上海生工生物股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及模型制备在DMEM培养液中加入10%胎牛血清及青链霉素，配置成完全培养液。将1.5 × 105个RAW264.7细胞培养于完全培养液中，并放置在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞完全贴壁后，取对数期RAW264.7细胞，分成Control组、ox-LDL组（100 μg/mL ox-LDL干预RAW264.7细胞24 h）、ox-LDL+Gap19组（20 nmol/L Gap19预处理30 min后加入100 μg/mL ox-LDL共同孵育24 h）及ox-LDL+Gap26干预组（20 nmol/L Gap26预处理30 min后加入100 μg/mL ox-LDL共同孵育24 h）。

1.2.2 油红O染色将密度为80% ～ 90%的RAW264.7细胞消化后接种于含盖玻片的六孔板中，取对数增长期细胞分成Control组及ox-LDL组，干预24 h后，按照南京建成说明书操作进行油红O染色，最后用水性封固剂封片，置于显微镜下观察拍照。

1.2.3 逆转录聚合酶链反应按照Total RNA提取试剂盒（Omega公司）说明书提取RAW264.7细胞总mRNA，按照逆转录试剂盒（Thermofisher公司）说明书进行逆转录，再取1 μL cDNA，并按照说明书配好扩增体系，加入反转录模板，置于实时荧光定量PCR仪器中，94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，26个循环；72 ℃ 延伸 5 min进行扩增。反应后，根据2-ΔΔCt值计算并分析各组细胞Cx43、Becline-1、LC3B的mRNA表达水平。相关引物序列号如下：GADPH：Forward：ACGGCAAGTTCAACGGCACAG，Reverse：CGACATACTCAGCACCAGCATCAC；Cx43：Forward：TCAAGCCTACTCAACTGCTGG，Reverse：TGTTACAACGAAAGGCAGACTG；Beclin-1：Forward：GTAGGGATGGAAGGGTCTAAG，Reverse：GCCTGGGCTGTGGTAAGTAAT；LC3B：Forward：CATGAGCGAGTTGGTCAAGAT，Reverse：TCGTCTTTCTCCTGCTCGTAG。

1.2.4 Western blot测定Cx43、Beclin-1、LC3B蛋白水平用RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白样品，经SDS-PAGE胶电泳分离后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。用含50 g/L脱脂牛奶室温封闭2 h；分别加入兔抗Cx43、Beclin-1、LC3B多克隆抗体（1∶1 000）或鼠抗GAPDH、β-actin 单克隆抗体（1∶10 000），4 ℃ 过夜；TBST溶液洗涤后，加入辣根过氧化物标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗（1∶15 000），室温孵育2 h；洗膜后，暗室中，加入ECL液，X线胶片暗盒中曝光。应用Image J 2×分析软件分析条带的吸光度值。

1.2.5 细胞免疫荧光染色检测Cx43、Beclin-1 、LC3B表达取对数生长期细胞，以1.5 × 105个/孔细胞接种于24孔板后培养24 h，按照实验分组进行干预后，去除培养基并洗涤。加入2 mL 4% 多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗涤细胞；加入1 mL 0.2% Triton-x 100，室温作用3 ～ 5 min后PBS洗涤；滴加BSA封闭液，37 ℃温箱内封闭0.5 h。用5%BSA封闭液稀释相应抗体：Cx43、LC3B、Beclin1，将对应抗体滴加在培养皿中的盖玻片上，放置湿盒中于4 ℃ 过夜。次日，将湿盒置于温箱中复温30 min后洗涤，擦拭多余的PBS，37 ℃ 避光孵育相应荧光二抗（山羊抗兔FITC）2 h，洗涤后向玻片上滴加即用型PI溶液100 μL，室温染核5 min后洗涤细胞，最后用量抗荧光淬灭封片剂封片，应用激光共聚焦显微镜采像并分析结果。

1.3 统计学方法本研究采用GraphPad Prism软件对实验数据进行统计分析，检测结果数据用均数±标准差表示。两组间比较采用t检验分析，多组间差异比较采用单因素方差分析，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ox-LDL对RAW264.7细胞自噬蛋白LC3及Beclin-1蛋白表达的影响使用ox-LDL（100 μg/mL）干预RAW264.7细胞后，分别在0、3、6、12、24、48 h检测LC3及Beclin-1蛋白表达，见图1A。在ox-LDL干预巨噬细胞的48 h内，LC3蛋白的表达量先增加后降低，在6 h表达量最大（P= 0.041 7），在48 h表达量最低（P= 0.217 3），见图1C。在ox-LDL干预巨噬细胞的48 h内，Beclin-1蛋白的表达量先增加后降低，在12 h表达量最大（P= 0.005 4）；在48 h表达量最低（P= 0.008 7）。

图1 ox-LDL对RAW264.7细胞自噬蛋白LC3及Beclin-1的影响Fig.1 Effects of ox-LDL on autophagy protein LC3 and Beclin-1 in RAW264.7 cells

2.2 ox-LDL诱导RAW264.7细胞泡沫化使用100 μg/mL ox-LDL干预RAW264.7细胞0 h及24 h后，使用油红O染色并进行光镜下检查，以观察RAW264.7细胞的泡沫化程度，见图2。与Control组相比，ox-LDL处理24 h后巨噬细胞胞浆内出现较多红染的脂滴，说明ox-LDL的干预能够促进细胞内脂质积聚，表明ox-LDL诱导的细胞泡沫化模型建立成功。

图2 ox-LDL诱导RAW 264.7细胞泡沫化（标尺 = 25 μm）Fig.2 ox-LDL induced cell foaming in RAW 264.7（scale = 25 μm）

2.3 ox-LDL促进RAW264.7细胞Cx43 mRNA及蛋白表达使用100 μg/mL ox-LDL干预RAW264.7细胞24 h后，qRT-PCR、Western blot及免疫荧光方法检测Cx43 mRNA及蛋白表达，以明确ox-LDL对Cx43表达的影响，见图3A-C。与Control组相比，ox-LDL诱导后，细胞中Cx43 mRNA（P= 0.000 3）和蛋白表达增加（P= 0.013 7）。图3D荧光结果显示，Cx43在RAW264.7细胞膜及细胞质中表达，且与Control组相比，ox-LDL组的荧光强度增加（P=0.000 3）。

图3 ox-LDL对RAW264.7细胞Cx43蛋白的影响（标尺= 25 μm）Fig.3 Effects of ox-LDL on Cx43 protein in RAW264.7 cells（scale =25 μm）

2.4 Cx43特异性阻断剂Gap26及Gap19增加Beclin-1及LC3B mRNA表达见图4A及4B，与Control组相比，ox-LDL组Beclin-1、LC3B的mRNA表达水平降低（PBeclin-1＜ 0.000 1，PLC3B= 0.000 4）。与ox-LDL组相比，特异性阻断剂的干预能够上调Beclin-1、LC3B mRNA表达水平（P26-Beclin-1= 0.006 3，P19-Beclin-1= 0.046 2，P26-LC3B= 0.000 8，P19-LC3B= 0.000 8，P26-Beclin-1= 12.55）。

图4 Cx43特异性阻断剂Gap26及Gap19对ox-LDL诱导RAW264.7细胞Beclin-1及LC3B mRNA表达影响Fig.4 Effects of CX43-specific blockers Gap26 and Gap19 on Beclin-1 and LC3B mRNA expression in RAW264.7 cells induced by ox-LDL

2.5 Cx43特异性阻断剂Gap26及Gap19增加Beclin-1、LC3B蛋白表达见图5，与Control组相比，ox-LDL组Beclin-1及LC3B蛋白表达减少（PBeclin-1=0.007 3，PLC3B= 0.016 5）。与ox-LDL组相比，特异性阻断剂的干预能够增加Beclin-1及LC3B蛋白表达（P26-Beclin-1= 0.006 8，P19-Beclin-1= 0.006，P26-LC3B= 0.039 7，P19-LC3B= 0.039 2）。见图6，免疫荧光结果显示与Western blot结果一致。Beclin1和LC3B主要定位在胞质和胞膜上，ox-LDL能抑制Beclin1和LC3B蛋白表达（PBeclin-1= 0.000 3，PLC3B= 0.007 9）；与ox-LDL组相比，Cx43特异性阻断剂Gap26、Gap19增加Beclin-1、LC3B蛋白表达（P26-Beclin-1= 0.017 2，P19-Beclin-1= 0.131 2，P26-LC3B= 0.002，P19-LC3B= 0.011 5）。

图5 Cx43 在ox-LDL 诱导RAW264.7 发生自噬中的作用Fig.5 Role of Cx43 in autophagy of RAW264.7 induced by ox-LDL

图6 Cx43在ox-LDL诱导RAW264.7发生自噬中的作用Fig.6 Role of Cx43 in autophagy of RAW264.7 induced by ox-LDL

3 讨论

AS是一种涉及多种类型细胞的慢性炎症性疾病［7-9］，其中脂质代谢紊乱和炎症被认为是AS发生的两个关键诱因［10-12］，而巨噬细胞在AS的启动及发展过程起到重要作用。在AS斑块形成过程中，单核细胞进入血管壁下内皮，转化为巨噬细胞，巨噬细胞能吞噬ox-LDL或其他修饰脂蛋白而转化为泡沫细胞。因此，ox-LDL在血管内皮中的沉积被认为是AS的起始因素［13］。已有大量研究证实，在晚期AS中巨噬细胞自噬能发挥保护作用［14-15］。本研究采用100 μg/mL的ox-LDL干预RAW264.7细胞0 ～ 12 h内，ox-LDL能促进RAW264.7细胞自噬蛋白表达增多，但ox-LDL干预RAW264.7细胞24 ～ 48 h能抑制RAW264.7细胞自噬蛋白表达（图1）。图2油红O染色显示，ox-LDL干预RAW264.7细胞24 h后，RAW264.7细胞脂质沉积，说明RAW264.7细胞发生泡沫化。CAO等［2，16］研究有相似的结果，100 μg/mL ox-LDL干预RAW264.7细胞24 h后，RAW264.7细胞内有大量脂质沉积，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1蛋白表达明显降低，这些研究说明ox-LDL诱导RAW264.7细胞自噬随着时间发生变化。本研究中ox-LDL干预RAW264.7细胞24 h，RAW264.7细胞发生泡沫化，且自噬蛋白LC3B及Beclin-1表达降低。由于巨噬细胞泡沫化是促进AS发展的重要因素，因此选择巨噬细胞泡沫化模型作为后续研究模型。

缝隙连接（gap junction，GJ）是细胞间通道，离子、小分子等物质能通过缝隙连接进行信息传递并建立细胞间联系。Cx43是GJ蛋白亚基，几乎在所有免疫细胞表达［17-18］。本团队前期研究发现，血管紧张素Ⅱ能通过Cx43/NF-κB通路诱导RAW264.7发生M1型极化，提示Cx43参与巨噬细胞功能。Cx43不仅是维持血管内皮连续性及完整性必须蛋白［19］，其也能影响多种免疫细胞活性调节AS发生发展。血管内膜内皮细胞Cx43高表达能诱导或促进内皮细胞功能障碍，例如：白细胞Cx43高表达能增强自身迁移及增殖能力［20］；平滑肌细胞Cx43高表达能抑制自身活性及增殖迁移能力［21］。在本研究中，与正常组相比，100 μg/mL的ox-LDL诱导RAW264.7细胞泡沫化，且RAW264.7细胞Cx43基因及蛋白增加，但自噬蛋白LC3B及Beclin-1表达降低。Cx43特异性阻断剂Gap26及Gap19干预后，RAW264.7细胞自噬蛋白Beclin-1及LC3B基因及蛋白表达增加，说明阻断Cx43的表达，促进ox-LDL诱导RAW264.7细胞自噬。

SHEN等［22］报道，脂多糖能通过调节诱导型NO合酶（iNOS）/黏着斑激酶（FAK）/Src通路增强巨噬细胞迁移能力，且巨噬细胞Cx43表达显著增多。据报道，在基因缺陷LDL受体的小鼠中，Cx43能参与平滑肌细胞迁移过程，其也能影响内皮细胞及白细胞功能及活性。GAO等［23］发现糖皮质激素能抑制蛋白激酶B（Akt）/雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）信号通路下调Cx43介导的自噬过程，从而破坏骨细胞之间联系。研究［24-25］报道，巨噬细胞自噬过程能促进脂滴降解以及游离胆固醇外排，抑制巨噬细胞泡沫化，该过程有助于拟转或者改善AS。以上这些研究说明，Cx43能通过多种信号通路及途径参与调节细胞功能。在本研究中，ox-LDL诱导RAW264.7泡沫化后，Cx43表达增高，而Cx43特异抑制剂Gap26及Gap19能增强RAW264.7自噬，提示通过抑制Cx43表达增强RAW264.7自噬，有助于改善AS发生发展，这可能是今后防治AS的策略之一，但具体调节机制需进一步探究。