枸杞多糖对绝经后骨质疏松患者肠道菌群结构及短链脂肪酸的影响*

卓嘉璐 李子祥 杨 宁 高明波 钱春花 韩 婷,#

绝经后骨质疏松症(Postmenopausal Osteoporosis,PMO)是一类由雌激素缺乏引起的全身性代谢性骨病,其特征为进行性全身性骨密度降低和骨组织微结构改变,易引起骨折或全身骨痛,从而导致疼痛、畸形甚至死亡等不良临床结局。据统计,我国25%-30%的绝经后妇女都患有骨质疏松症,且其发病率呈逐年上升趋势[1],严重损害了中老年妇女的身体健康及生活质量[2],现已成为亟待解决的临床问题之一。肠道菌群被认为是机体一个重要的“特殊器官”,菌群种类的动态平衡和变化在维持人体健康中起着至关重要的作用[3]。近年研究表明,PMO患者的肠道微生物群组成发生变化,包括丰富度和多样性下降、有益菌及致病菌比例失调等[4],认为肠道菌群失调与机体骨密度调控相关,可能是干预PMO的新靶点[5]。

益生元是一种由肠道菌群发酵、耐胃酸和水解酶而不被肠道消化吸收的食物成分。现有的证据表明,益生元对骨代谢具有调节作用,可使肠道菌群中的有益菌代谢更多的短链脂肪酸(Short-chain Fatty Acids,SCFAs),而SCFAs是破骨细胞新陈代谢和骨质的有力调节者[6]。益生元还可调节免疫系统,影响钙吸收和转化、促进骨的形成和骨矿化、增加骨密度,改善骨质疏松[7]。枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides,LBPs)是一种潜在的益生元,有利于增强肠道微生物群的活性。已有研究表明枸杞多糖具备潜在益生元的作用,不仅能够改善机体免疫功能及氧化应激引起的全身炎症反应,而且还能通过其生物活性影响肠道菌群和代谢产物,在调节肠道微环境、改善宿主健康和靶向肠道效应方面具有积极影响[8]。但鲜有研究报道枸杞多糖在骨质疏松症的预防和辅助治疗中的作用,尤其是枸杞多糖对骨质疏松症肠道微生态的系统性研究还缺乏相关数据。

人体肠道微生态系统模拟装置(Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem,SHIME@)是比利时根特大学设计的一套包含胃、小肠以及大肠的完整模拟消化系统,能够有效模拟人体的消化及肠道微生态环境,是研究体外胃肠道不同部位对肠道菌群组成影响的有效工具。本研究拟应用SHIME@模拟人体消化系统,使用枸杞多糖对其进行干预,检测并分析系统产出的发酵液,研究枸杞多糖对PMO患者肠道菌群及其代谢产物SCFAs的影响,从而进一步探讨枸杞多糖对预防与治疗骨质疏松的作用机理。

1 材料与方法

1.1 试验试剂

枸杞多糖(上海源叶生物科技有限公司);标准品:乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、异丁酸、异戊酸(美国Sigma公司)。SHIME的营养培养基批号为PDNM001B(ProDigest,Ghent,Belgium),由阿拉伯半乳聚糖(1.2g/L)、果胶(2g/L)、木聚糖(0.5g/L)、葡萄糖(0.4g/L)、酵母提取物(3g/L)、蛋白胨(1g/L)、粘蛋白(2g/L)、L-半胱氨酸盐酸盐(0.5g/L)和淀粉(4g/L)组成。胰液含有碳酸氢钠(12.5g/L)、牛胆汁(6g/L)、胰蛋白酶(0.9g/L)。

1.2 粪便供体

粪便供体为上海第十人民医院进行住院治疗的PMO患者3例,纳入标准:(1)年龄60-75岁,绝经妇女;(2)近6个月内无抗生素治疗史;(3)未接受过膳食补充剂(钙、维生素D)、益生菌、益生元治疗;(4)无慢性或自身免疫性疾病史(例如消化道疾病、肾脏疾病、肝脏疾病,心血管疾病、甲状旁腺疾病)。本研究按照《赫尔辛基宣言》规定的指导方针进行,所有涉及人类受试者的程序均经上海第十人民医院伦理委员会批准(批准文号:2020KT50),所有受试者在纳入研究前均获得书面知情同意。

1.3 粪便样本的采集和处理

清晨采集患者的中间段新鲜粪便,尽量避免尿液、灰尘等污染。称取新鲜粪便,加入厌氧磷酸盐缓冲溶液(0.1M PBS,pH=7.4)配制成10%(w/v)的粪便悬液,涡旋仪上混匀5s,静置10min后取上层溶液进行离心(4℃、1 000r/min、10min),收集离心后的上层溶液进行体外模拟发酵实验。

1.4 SHIME@

使用SHIME@(ProDigest,University of Ghent,Ghent,Belgium)评估长期摄入枸杞多糖对肠道微生物群的影响。本研究使用Triple-SHIME设置,由三个独立的SHIME@系统并行运行,每个系统包括三个连续反应器,分别为胃/小肠反应器(Stomach/Small Intestinal,ST/SI)、近端结肠(Proximal Colon,PC)和远端结肠(Distal Colon,DC)反应器。PC和DC反应器保持恒定体积,分别为500ml和800ml,pH值控制在固定范围内(PC为5.6-5.9和DC为6.6-6.9)。

实验开始时,将粪便接种液(10% w/v)以5%(v/v)的体积分别接种于两个结肠反应器。初始静态发酵16h后,将140ml SHIME营养培养基(3次/天)和60ml胰液(3次/天)泵入ST/SI反应器中,然后将反应器内混合物泵入PC和DC,多余的液体被泵到废液容器中。实验期间所有反应器都是密闭的,在37℃下连续搅拌并用氮气冲洗以保持厌氧环境。

SHIME@运行包括2个阶段:第一阶段为稳定期(S)。模型中添加营养培养基,经过两周的时间(Sw1、Sw2),粪便微生物群适应两个结肠区域的环境条件,并达到稳定状态。第二阶段为治疗期(T),为期2周(Tw1、Tw2),在营养培养基中以10g/L的剂量添加枸杞多糖(根据前期团队的剂量学研究结果,枸杞多糖添加量为10g/L时降解率最高)。从PC和DC反应器采集样本,包括稳定期第2周(Sw2,Day14),治疗期的第1周(Tw1,Day21)和第2周(Tw2,Day28),用于后续检测。实验设计见图1。

1.5 SCFAs检测

利用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测体外发酵液中SCFAs的浓度。(1)色谱条件:采用ACQUITY UPLCBEH C18色谱柱(2.1mm×100 mm,1.7μm,Waters,USA),柱温40℃,流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈:甲醇(2∶1,v/v),进行梯度洗脱(0-2min,80%A; 2-8min,80%A-60%A; 8-9.5min,60%A-5%A; 9.5-10min,5%A-80%A),流动相流速为0.4ml/min,进样量为2μl。(2)质谱条件:采用多反应离子监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM),电喷雾离子源(ESI),正负离子模式,正离子喷雾电压:5 500V;负离子喷雾电压:4 500V,离子源温度500℃,气帘气35psi,雾化气50psi,加热辅助气60psi。(3)样品处理:取100μl 1.4中采集的样品至离心管中,加入150μl 50%乙腈水溶液,涡旋3min,离心(10min,4℃,12 000rpm),取80μl上清至离心管中,再加入40μl 200mM 3-NPH(50%乙腈水溶液配置,v/v)和40μl 120mM EDC-6%吡啶(50%乙腈水溶液配置,v/v),40℃下反应30min,反应后取150μl进行氮吹,150μl乙腈水溶液(1∶3)复溶,过滤(0.22μm的有机滤膜)后转移到棕色进样瓶,上机分析。分别配制乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、异丁酸、异戊酸标准品的系列浓度梯度,定量分析后绘制标准曲线,用于待测样本SCFAs的计算。

1.6 16S rRNA基因测序和序列分析

采用DNA抽提试剂盒提取样本的基因组DNA,利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度,以基因组DNA为模板,选取16S区域中V3-V4区作为扩增区域,使用带barcode的特异引物,Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase进行两轮PCR扩增,上游引物序列为5’-TAC GGR AGG CAG CAG-3’,下游引物序列为5’-AGG GTA TCT AAT CCT-3’。对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样,使用Illumina MiSeq平台进行高通量测序(上海欧易生物医药科技有限公司)。

由Illumina MiSeq平台测序所得原始数据为FASTQ 格式。首先使用Cutadapt软件对原始双端序列进行去杂处理。然后使用DADA2将去杂处理后的双端系列按照QIIME 2(2020.11)默认参数进行质量过滤,降噪,拼接及去嵌合体等质控分析,得到代表序列及ASV丰度表格,将所有代表性序列与Silva(version138)数据库进行比对注释。基于物种注释结果,进行α-多样性指数分析,包括Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和ACE指数等。α-多样性分析是微生物多样性分析中一个重要的组成部分,Chao1和ACE指数能够反映菌群丰度,Shannon和Simpson指数则说明群落中个体分配的均匀度,即多样性。采用Bray-Curtis的主坐标分析(Principal Co-ordinates Analysis,PCoA)对样品间微生物群落的结构变异(β-多样性指数)进行展示。

1.7 统计学处理

2 结 果

2.1 发酵液中的细菌物种鉴定及菌群结构分析

门水平群落结构面积图如图2所示。优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、变形菌门(Proteobacteria)及放线菌门(Actinobacteria)。经过枸杞多糖干预后,放线菌门的相对丰度呈降低趋势,变形菌门的相对丰度呈上升趋势,但由于患者间存在个体差异性,在患者3中尤为显著。在科水平上,枸杞多糖降低了Lachnospiraceae和Ruminococcaceae的丰度(图3)。

注:A、B和C分别代表三例患者样本。A3、B3、C3:稳定期(Sw2)PC样本;A4、B4、C4:稳定期(Sw2)DC样本;A11、B11、C11:治疗期(Tw1)PC样本;A12、B12、C12:治疗期(Tw1)DC样本;A15、B15、C15:治疗期(Tw2)PC样本;A16、B16、C16:治疗期(Tw2)DC样本。

注:A、B和C分别代表三例患者样本。A3、B3、C3:稳定期(Sw2)PC样本;A4、B4、C4:稳定期(Sw2)DC样本;A11、B11、C11:治疗期(Tw1)PC样本;A12、B12、C12:治疗期(Tw1)DC样本;A15、B15、C15:治疗期(Tw2)PC样本;A16、B16、C16:治疗期(Tw2)DC样本。

属水平物种组成分布如图4所示。3例患者个体差异较大,枸杞多糖干预对近端和远端结肠的菌群结构影响较大,共有的菌属主要为大肠-志贺氏杆菌属、拟杆菌属、双歧杆菌属、萨特氏菌属、小杆菌属。乳杆菌属在患者3中显著增殖,尤其在患者近端结肠中富集。

注:A、B和C分别代表三例患者样本。A3、B3、C3:稳定期(Sw2)PC样本;A4、B4、C4:稳定期(Sw2)DC样本;A11、B11、C11:治疗期(Tw1)PC样本;A12、B12、C12:治疗期(Tw1)DC样本;A15、B15、C15:治疗期(Tw2)PC样本;A16、B16、C16:治疗期(Tw2)DC样本。

2.2 多样性分析

即本研究图5结果显示,Good’s coverage指数趋近于1,说明测序深度已能覆盖到样本中的所有物种,结果准确可靠。如图6所示,远端结肠物种多样性较近端结肠丰富,在枸杞多糖干预一周后,物种多样性达到峰值,再随着干预时间降低,然而组间各多样性指数差异无统计学意义。β-多样性分析显示不同患者之间相互分离,说明组间微生物群的组成存在明显差异性(图7)。

图5 Good’s coverage测序深度指数

A:Chao1指数;B:Shannon指数;C:Simpson指数;D:ACE指数。

图7 β-多样性PCA分析2.3 SCFAs含量变化分析

如表1所示,枸杞多糖治疗后,SCFA水平升高。枸杞多糖治疗均显著提高了结肠区域的乙酸水平(P<0.05),且远端结肠中的乙酸含量增加最为明显。近端结肠和远端结肠用枸杞多糖干预后丙酸水平显著高于稳定期(P<0.05)。与稳定期相比,近端结肠和远端结肠的丁酸水平显著升高(P<0.05)。与稳定期相比,枸杞多糖使结肠中总SCFAs水平显著升高(P<0.05)。

表1 枸杞多糖干预对近端和远端结肠中各SCFAs含量的影响(mg/ml)

3 讨 论

本研究使用的SHIME@人体肠道微生物生态模拟系统,是由比利时根特大学研制出来的一套包含胃、小肠以及大肠的完整模拟消化系统。此系统的设计着重于模拟结肠微生物群,具有稳定性好、采集样品方便、节省时间等优点[10-12]。

肠道微生物群及其代谢产物(如短链脂肪酸)可维持骨骼健康和骨质量,其机制可能包括免疫作用、营养物质吸收、调节雌激素等[13]。鉴于过往研究已证实枸杞多糖在上消化道中是不可消化的,并且可以被肠道微生物利用[8]。且枸杞多糖的免疫调节作用已被广泛认识,其机制可能为增强肠粘膜免疫屏障的完整性、调节肠道微生物群及其代谢产物等[14]。本研究发现,枸杞多糖影响PMO患者的肠道微生物群。通常来说,肠道菌群主要分为厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门,其中拟杆菌门和厚壁菌门占90%以上。干预前,患者的优势菌门为厚壁菌门、变形菌门、及放线菌门。经过枸杞多糖干预后,整个微生物群落结构被调节,患者的放线菌门的相对丰度明显减少,变形菌门的相对丰度相对增加。毛螺菌科(Lachnospiraceae)属于厚壁菌门,属于厌氧菌,在体外和动物实验中发现,毛螺菌科通过使用膜锚定白介素-6(IL-6)受体降低肠道IL-6水平来抑制骨再生和重塑[15]。高剂量补充枸杞多糖显著降低毛螺菌科的丰度,这与本研究结果一致[9]。Li等[16]发现毛螺菌科的丰度与骨密度及T-评分呈正相关。然而,不同研究报道了相互矛盾的结果,毛螺菌科与骨代谢的关系仍不一致,需要进一步功能研究来验证[17]。

本研究发现α-多样性指数差异无统计学意义,这与Li等[9]动物实验报道的结果一致,枸杞多糖干预对肠道菌群多样性和丰富度的影响不明显。β-多样性分析显示不同患者之间相互分离,也进一步说明组间微生物群的组成存在明显差异性。值得注意的是,在这一过程中,枸杞多糖使患者3的乳酸杆菌显著增殖。虽存在个体差异性,但这些数据与其它研究发现的枸杞多糖可提高小鼠肠道中乳杆菌相对丰度的最新报道相是一致[18]。乳杆菌在增强肠道上皮屏障功能、刺激肠道上皮增殖和抑制先天性炎症信号通路方面非常有效[19]。动物实验表明,乳杆菌可改善骨的微结构及生物力学,并调节CTX-I、PINP、Ca及RANKL的表达,恢复Th17/Treg平衡,从而缓解卵巢切除大鼠的骨质疏松[20]。本研究中部分患者乳酸杆菌显著增加,从一定程度上也提示在PMO女性患者中补充枸杞多糖可显著减少骨质流失,但未来需更大规模的临床试验进一步验证,并探讨相关机制。此外,乳酸菌也可利用枸杞多糖产生 SCFAs[21]。SCFAs已被证明可调节全身骨量,可对炎症反应产生影响,保护其免受病态骨质流失[22]。

为了进一步明确结果,本研究对肠道菌群的代谢产物也进行了分析。结果发现枸杞多糖的干预使肠道菌群代谢产物含量变化,具体表现为乙酸、丙酸、丁酸含量上升,而这些都是SCFAs的主要组成部分。SCFAs 是肠道细菌从未消化的碳水化合物中产生的重要代谢产物,最新研究也观察到枸杞多糖的免疫调节作用通路背后的机制是潜在的免疫介导效应,通过调节肠道微生物群代谢产物[23]。其中,有研究证实,丁酸可使小鼠肠道和骨髓中调节性T细胞(Treg)增多,进而活化成骨细胞的Wnt信号通路,刺激骨生成[24]。乙酸是主要的 SCFAs,可被结肠上皮吸收,是骨、外周组织代谢的能量来源[25]。本研究观察到,与稳定期相比,枸杞多糖被发酵成不同的 SCFAs,提高了结肠内容物和粪便中 SCFAs 的总浓度,这表明摄入枸杞多糖可能对骨健康有益。这也与先前的研究报道一致。多项研究表明,多糖可作为益生菌代谢过程中的碳源,并分解成单糖,为益生菌提供能量,可增加 SCFAs(如乙酸、丙酸和丁酸)的浓度[26]。

综上所述,本研究使用SHIME@模拟人体胃肠道,运用10mg/ml枸杞多糖进行干预,发酵液分析结果显示,枸杞多糖可能通过调整肠道菌群结构,促进SCFAs的生成,对骨健康产生一定影响,为临床进一步研究提供了理论依据。