国内多囊卵巢综合征动物模型构建的现状及评价

耿红玲 顾春晓 徐 珉 陈 颐

(广东省中医院妇科,广州,510120)

多囊卵巢综合征(Polycystic Ovary Syndrome,PCOS)是一种常见的妇科生殖内分泌异常疾病,其发病机制复杂,但确切病因病理尚不明确。针对PCOS动物的造模多种多样,我们检索了相关文献,将文献中对PCOS造模选用的动物品系、造模药物、时长,模型评价等方面进行分析,以期对PCOS造模有所帮助。

1 资料与方法

1.1 文献来源 中国知识基础设施数据库(China National Knowledge Infrastructure,CNKI)、中国学术期刊数据库(China Science Periodical Database,CSPD)、中文科技期刊数据库(Chinese Citation Database,CCD)。

1.2 检索策略 检索2017年1月1日至2021年3月10日CNKI、CSPD、CCD数据库关于PCOS模型的相关文献。发现国内暂未采用猴、猪、兔、羊动物构建PCOS模型,1篇采用斑马鱼构建PCOS模型[1],更多采用的是啮齿类动物。CNKI、CSPD采用题目或关键词:多囊卵巢综合征或PCOS合并摘要鼠。CCD采用题目/关键词:多囊卵巢综合征或PCOS合并任意字段鼠。

1.3 纳入标准 PCOS基础研究,并且文中具体提到PCOS模型构建的方法。

1.4 排除标准 临床类、综述类、会议论文、比较不同动物模型的文献。

1.5 数据的规范与数据库的建立

1.5.1 数据的规范 由2位研究者检索文献并核实最终获取文献,对来源同一课题组或同一作者(但研究方法一样)的不同文献视为一篇。2位研究者录入数据并保证真实准确。

1.5.2 数据库的建立 建立Excel表格,分为品系、周龄,造模药物,时长,高脂饮食,造模评价条目,分析文献后逐条填入。

1.6 数据分析 共获取文献中选用的动物品系、鼠龄、造模药物、造模时长、有无高脂饮食,造模评价等条目进行分析。

2 结果

2.1 动物品系和鼠龄选择 品系:以大鼠使用最多,占比91.0%,小鼠占比9%。鼠龄:大鼠鼠龄多选用21～24日龄,占比44.2%,其次是大于24日龄小于60日龄,占比38.9%。在小鼠的文献研究中,鼠龄选用最多的是21～30 d,占比82.3%。见表1。

表1 品系分布及鼠龄文献数量

2.2 造模的方法

2.2.1 药物选择 目前文献中啮齿类PCOS动物模型通常采用雄激素、芳香酶抑制剂、人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotrophin,hCG)+胰岛素、雌激素、抗孕激素以及改变光照等手段构建PCOS模型,其中造模方法采用最多的是雄激素造模,占比55.6%,其次是来曲唑造模,占比33.3%。见表2。

表2 造模药物

2.2.2 造模时长 各种造模方法中造模时长最多的20～30 d,占比79.4%。见表3。

表3 造模时长

2.3 是否添加高脂高糖饮食 文献中26.5%造模过程中联合高脂高糖饲料喂食。

2.4 模型评价 文献中造模后未对模型是否成功进行评价的占比31.2%,对模型进行评价的占比68.8%。所采用的模型评价方法中:单纯选用阴道涂片方法的占比31.7%,其次是阴道涂片联合血清学的方法,占比12.2%。见表4。

表4 模型评价

2.5 中医证型的选择 文献中专门针对中医证型建立PCOS模型,分别为肾阴虚[2]、肾阳虚[3]及痰湿型[4]。

3 讨论

3.1 动物选择 大鼠因对性激素敏感,有较稳定的动情周期,而且对于实验研究又经济方便,因此是研究PCOS的首选动物。大鼠8周龄时性成熟,哺乳期为21 d。小鼠35～50日龄性成熟,哺乳期21 d。文献中最多选用的是刚脱离哺乳期的鼠,其次是选用哺乳期后至性成熟期前的鼠,根据大鼠年龄与相当于人的年龄的换算,1～8周龄的大鼠相当于人的年龄的8岁,表明绝大多数文献选用的动物在青春前期或青春期,并非处于性成熟期的育龄期。根据“青春期发育亢进学说”,假性性早熟已被确定为儿童日后发展成PCOS的危险因素之一,故刚离乳幼年雌性大鼠最为常用[5]。未断乳的鼠在饲养及造模过程中容易死亡,故采用较少。1篇选用20周动物造模与其研究氧化损伤及组织退行性变化的亚急性衰老有关[6]。对年幼阶段动物的研究是否也适用育龄女性的PCOS的认识,不同年龄段的PCOS动物模型是否存在差异,对于从来没有规律的性周期与既往有过规律的性周期的动物造模,有无区别,值得进一步实验验证。

3.2 造模方法 采用最多的是雄激素及来曲唑构建模型。雄激素造模原理:脱氢表雄酮硫酸酯的原料药不溶于水,硫酸普拉睾酮钠是脱氢表雄酮硫酸酯的硫酸钠盐制剂。因脱氢表雄酮硫酸酯为油剂,不易吸收,在造模时可采用溶液酒精灯加热溶解均匀后,并轻轻揉按注射部位促进吸收[7]。注射脱氢表雄酮硫酸酯是外源性途径提高脱氢表雄酮硫酸酯水平,造成雄烯二酮水平增高,进而睾酮及雌酮水平升高,造成PCOS高雄激素血症。升高的雌酮水平对促卵泡素负反馈使促卵泡素相对不足,从而导致卵泡发育障碍及卵巢多囊改变。长期暴露于DHT、丙酸睾酮可导致大鼠排卵功能障碍。但是人PCOS与通过外源注射雄激素所建立起来的动物模型在对治疗的反应、形态及激素改变等许多方面都有很大差别,故停用脱氢表雄酮硫酸酯后恢复排卵的周期仍有待进-步商榷[8]。

来曲唑造模原理:来曲唑为芳香酶抑制剂,通过抑制雄激素向雌激素转化的限速酶——芳香化酶的活性,导致体内雄激素的增加,形成高雄激素血症,进而发展为多囊卵巢。来曲唑诱导动物模型表现为PCOS生殖和代谢两方面症状,但停止来曲唑诱导后,小鼠生殖功能恢复。同时,该模型不适合研究雌激素高的多囊卵巢综合征[9]。

hCG+胰岛素法造模原理:胰岛素能刺激卵巢卵泡膜细胞和间质细胞合成雄激素,降低血中性激素结合蛋白,使雄激素浓度增加。hCG发挥类促黄体素的作用,在卵泡早期使用,可导致卵泡闭锁。该模型卵巢呈多囊化、无排卵,大鼠体内持续促黄体素样作用,出现高胰岛素血症和高雄激素血症。虽然该模型的研究数量不如雄激素模型那么多,但该模型呈典型PCOS特征与临床症状高度相似[9],并认为胰岛素(Insulin,INS)+hCG法诱导的大鼠模型其生殖及代谢指标的变化较来曲唑更具优势[10]。

孕激素+hCG法原理:皮下埋避孕棒,可抑制下丘脑-垂体-卵巢(Hypothalamic-pituitary-ovarian,HPO)轴,使性激素分泌呈低水平,导致不排卵。此种造模方法时间较短。1篇左炔诺孕酮硅胶棒联合hCG,造模时间10 d[11]。1篇皮下埋植左旋18-甲基炔诺酮硅胶棒(75 mg),3 d后2次皮下注射1.5 IU/0.2 mL hCG,共注射9 d[12]。此种模型卵巢与PCOS患者病理形态学和血浆激素水平相似。但该模型对HPO轴相关的PCOS的病因分析具有局限性[9]。

米非司酮造模原理:抗孕激素米非司酮作为一种强效的抗孕激素药物,具有较强的抑制排卵作用。使用抗孕激素米非司酮造模后卵巢持续不排卵与血清促黄体素升高的同时作用促进卵巢多囊样改变的形成;同时高水平的促黄体素能够促进抑制素水平的升高,从而导致促卵泡素下降,促黄体素高表达能促进雄激素的合成,表现为睾酮水平明显升高,促使卵泡闭锁,具有PCOS的不排卵,雄激素增高的典型特征[13]。该种方法造模时间不长,文献[14-15]分别为9 d、14 d。

雌激素造模原理:长期雌激素刺激可致下丘脑神经元退化,垂体出现代偿性增生,并对促性腺激素释放激素刺激出现异常反应,导致促黄体素显著升高,同时促卵泡素也会升高。虽然戊酸雌二醇诱导啮齿动物PCOS模型中卵巢的生理学和解剖学与人类相似,但未见人类典型代谢异常数据,该模型不适合下丘脑-卵巢轴相关研究。此外,雌激素模型的性激素特征和卵巢形态特征也不一致[9]。

光照造模原理:啮齿动物发情周期与昼夜系统相关,光暗周期可以控制动物促性腺激素和排卵情况。持续光照在无激素条件下可诱导PCOS模型,但该模型转至正常光照周期环境,PCOS特征可恢复正常[9]。因此,需要进一步评估该模型在PCOS病因和发病机制与PCOS患者的相似性。

其他还有单纯高糖高脂饮食构建PCOS模型,该造模方法并非由外源激素诱导或通过改变类固醇生成途径诱导,高脂高糖饮食可导致大鼠出现高胰岛素血症,胰岛素水平升高可导致卵巢卵泡膜细胞的雄激素产生增加。雄激素水平升高与无排卵有关,并加速大鼠卵泡闭锁,从而导致生殖健康受损及代谢紊乱[16]。亦提示高脂高糖饮食为PCOS潜在病因,但此种造模时间较长,造模时间为14周以上。

针对造模时长张萍等[17]研究发现脱氢表雄酮硫酸酯诱导20 d的PCOS大鼠模型,经历4周后,不存在自愈,与持续造模相比更为简便易行,同时其卵巢形态结构以及激素水平变化也更符合临床表现,但此模型因其药物未被完全吸收,如研究激素水平,需要预留一定时间使其吸收。另一项模型研究表明来曲唑联合高脂膳食连续喂养27 d,可成功复制符合PCOS胰岛素抵抗患者病理特征及内分泌、代谢紊乱的大鼠模型[18]。对于多长时间可以造模成功,可能与造模药物种类及方法有关。

虽然PCOS造模方法多种,但没有哪一种可以比较全面反映PCOS的特征,也体现出PCOS疾病的复杂性及高度的异质性,需要不断探索,寻找更贴近PCOS本质的造模方法。

3.3 是否添加高脂高糖饮食 26.5%的文献提到造模过程中联合高脂高糖饲料喂养,考虑到PCOS是一种代谢异常的疾病,常合并糖脂代谢的异常,故在行药物造模的同时常采用高脂高糖饲料喂养,是否添加高脂高糖饮食与自己所研究的方向及目的相关。

3.4 模型评价 动物实验模型成功的建立是前提,是进行下一步研究的基础,只有动物的造模是成功的,其研究结果才有可信性。PCOS动物模型评价使用最多的是单纯阴道涂片,此种方法简单易行,可帮助判断动物是否存在规律的性周期变化,是否处于无排卵状态。如果连续2个性周期阴道上皮细胞持续角化现象,并失去规律的动情周期则提示无排卵。其次是采用生化指标评价,此种评价方法包括检测性激素、生化指标等协同判断模型的成功与否,较单纯的阴道涂片更进一步。此外是病理学指标,病理主要是观察卵巢的镜下改变是否符合PCOS改变,一般是随机抽取判断。病理学指标是评价PCOS模型的Ⅰ类指标,可准确、直接说明PCOS的病变组织形态特点,权重系数0.4[5],光镜下见卵巢呈多囊样改变,白膜增厚,闭锁卵泡数目增多,卵泡膜细胞层增厚,可见黄体和白体明显减少。颗粒细胞层增厚,颗粒细胞层数减少,仅为数层,颗粒细胞排列致密、染色加深是PCOS典型表现。生化指标是Ⅱ类指标,PCOS模型建立后性激素及胰岛素抵抗指数会出现变化,生化指标变化是PCOS发生、发展、康复过程的机体反映,也是模型成功与否的指征,但特异性稍低,权重系数为0.4[5]。表观指标是Ⅲ类指标,PCOS最直接的判定标准是表观指标的变化,模型建立后,可见模型动物闭经、体质量明显增加、卵巢表面苍白,卵巢包膜增厚明显,体积增大,重量增大。根据表观指标的特点,有利于模型的判断,但由于其特异性不强,表观指标权重系数0.2[5]。模型评价尽量选用权重系数较高的指标,虽然阴道脱落细胞涂片未被列入评价指标中,但因其方便快速,简易可行被研究者广泛采用。同时对模型评价不应局限于一种方法,可2种甚至3种方法联合来判断模型的成功与否。此外,造模后研究者时常进行治疗药物干预,在治疗药物干预期间,模型鼠是否会恢复正常状态亦是需要考虑的问题,所以也有在治疗药物干预期间继续进行造模药物的使用,防止大鼠恢复排卵[19],保证疾病模型的持续存在,但是此种情况存在造模药物的持续使用是否对治疗药物的治疗效果产生影响的问题。

3.5 中医证型选择 方证对应是中医辨证方法及理论的最终体现,也是中医药发挥临床疗效的最终落脚点。所以在对中医药进行实验研究时,应考虑与中医药相对应的证型问题。在获取的文献中,有3篇专门针对中医证型建立PCOS模型,虽然有的文献提到痰湿证但其造模方法与非痰湿证模型并无明显不同。此外亦有来曲唑联合细菌内毒素法建立PCOS肾虚血瘀的模型[20]。临床中患者中医证型不同,其PCOS的表现及生物学指标不尽相同,在动物实验时,尤其是涉及到中医药的研究,可能考虑到病证结合才能做到与临床更为贴近,更加符合中医药的辨证论治,才能更好研究辨证用药的作用机制,才会有更强的说服力。

综上所述,PCOS造模采用最多的是雄激素及来曲唑构建模型,并且对于药物剂量及干预时长较统一稳定。在动物造模时尽量选用比较成熟的造模方法,以保证造模的成功,同时亦需要不断地尝试和探索新的造模方法,以求建立更符合临床特征的PCOS动物模型。

利益冲突声明:无。