PDTC对1型糖尿病肾病小鼠VEGF、PEDF表达的影响杨慕涵

,王显鹤,董 静,聂 影,王丽敏,杨占双

(1.佳木斯大学,黑龙江 佳木斯 154007;2.佳木斯大学附属第一医院儿科,黑龙江 佳木斯 154003)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus)常见的、也是最严重的并发症之一[1],呈慢性[2]、进行性发展态势,也是导致终末期肾病(end-stage kidney disease,ESRD)最主要原因[3],其逐渐增加的发病率不仅影响了患者的生活质量,也给卫生医疗与社会经济增加了负担[4]。DN作为糖尿病重要的微血管病变[5],其主要特征是微血管的损伤,包括肾小球高滤过、白蛋白尿增加,以及肾损伤,最终导致肾小球功能障碍和肾衰竭[6,7]。DN起病隐匿,早期临床表现不明显,中晚期病情发展迅速且对肾功能产生不可逆转的损害,严格的血糖和血压控制的标准疗法已被证实无法阻止DN进展到ESRN[8]。因此,在DN形成的早期通过抗血管生成来延缓DN的发展对未来预防及治疗DN可能存在一定的意义。

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamic acid ammonium salt,PDTC)属二硫代氨基甲酯化合物(dithiocarbamate compound),已有大量的研究发现其对多种疾病具有潜在治疗效果[9]。作为抗血管生成剂通过抑制依赖kappaB的血管内皮生长因子(如VEGF)的分泌[10],从而影响新生血管的形成,而血管生成已被证实是DN早期的潜在治疗方向,因此,本实验在糖尿病小鼠模型建立后给予PDTC,根据糖尿病肾病小鼠建模后VEGF及PEDF因子表达的变化及相关指标的检查来探讨PDTC在早期延缓DN的发展可能存在的意义并为其作用机制提供研究思路。

1 材料与方法

1.1 材料

3周龄SPF级BALB/c雄性小鼠36只,体质量(21.77±1.15)g,由珠海百事通生物科技有限公司提供,广州华腾生物动物饲养室统一普通饲料饲养,链脲佐菌素(STZ)、PDTC购自Servicebio生物科技公司。VEGF、PEDF抗体购自Immunoway。

1.2 方法

36只3周龄雄性BALB/c小鼠,适应性喂养1周后,随机分为对照组,T1DN组,PDTC组,每组12只。将STZ用柠檬酸缓冲液配制为20mg/mL的STZ注射液,以0.1mL/10g对T1DN组、PDTC组小鼠进行一次性腹腔注射制作1型糖尿病模型,一周后连续72h空腹血糖≥16.7mmol/L,C肽≤0.8ng/mL,伴多饮、多食、多尿,即为1型糖尿病成膜,此模型连续4周出现微量白蛋白尿,C肽降低,为1型糖尿病肾病模型。1型糖尿病成膜后连续2周PDTC组隔日一次腹腔注射PDTC 60mg/kg,对照组、T1DN组同体积生理盐水腹腔注射。

1.3 体质量、血生化指标检测

4周后,测量记录小鼠体质量,异氟烷吸入麻醉,拔眼球采血分离血清待行生化检测,处死小鼠取出胰腺和肾脏常规脱水,浸蜡,包埋,切片。

1.3.1 肾、胰病理学检查:HE 染色,观察胰腺、肾脏病理形态改变。

1.3.2 免疫组化染色:使用数字病理图像分析软件Aipathwell进行AI扫描分析,计算3组肾组织VEGF、PEDF阳性染色(棕色颗粒)的平均光密度值,使用SPSS23.0统计软件对数据进行统计及处理。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般状态

实验结束后,对照组小鼠精神状态及毛发无明显改变,体质量未见减低;T1DN组小鼠被毛污秽,毛发稀疏,行动迟缓,活动减少,精神萎靡不振、烦躁,多饮多食多尿明显;PDTC 组小鼠被毛污秽,毛发稀疏,行动及精神状态较T1DN组轻微好转,多饮多食多尿。

2.2 体质量及血糖

实验结束后,与对照组相比,T1DN 组、PDTC 组小鼠体质量明显降低,空腹血糖明显增高,差异有统计学意义(P<0.05);与T1DN组对比,PDTC组小鼠体质量有所增加,空腹血糖降低,仍高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图1、表1。

表1 实验前后各组小鼠空腹血糖的变化

图1 实验前后各组小鼠体质量变化(×200)

2.3 血生化检查

与对照组相比,T1DN组小鼠BUN、Cr、血清胰岛素水平及β细胞功能指数明显降低,HbAlc升高,差异具有统计学意义(P<0.05);与T1DN组相比,PDTC组小鼠BUN、Cr、血清胰岛素水平及β细胞功能指数升高,HbAlc降低,但仍高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2-3。

表2 各组小鼠血尿素氮、血肌酐、糖化血红蛋白的变化

表3 各组小鼠空腹胰岛素、β细胞功能指数对比

2.4 肾脏、胰腺病理学改变

对照组胰腺外分泌部主要由腺泡细胞构成,被薄层结缔组织分隔成多个小叶,小叶内腺泡排列紧密,腺泡细胞顶部嗜酸性,基部嗜碱性,形态正常,胰岛数量丰富,形状规则,近似圆形或椭圆形,胰岛细胞排列紧密,胞浆丰富,形态正常,组织未见明显异常;T1DN组与对照组相比,胰腺萎缩,小叶截面普遍变小,胰岛数量明显减少,伴胰岛萎缩,体积变小,胰岛细胞排列疏松,胞浆减少,或疏松淡染或呈空泡状,间隙增大,小叶间质广泛见少量或无炎性细胞散在浸润;PDTC组病理改变程度介于上述两组之间。对照组肾小管排列紧密,肾小管上皮细胞着色均匀,胞质丰富,形态正常,肾小球毛细血管丛清晰,组织未见明显异常;T1DN组肾小管排列紧密,肾小管上皮细胞肿胀,胞浆疏松淡染,管腔可见嗜酸性碎片,肾小管上皮细胞核肿大,肾小球毛细血管丛清晰,肾小动脉周围炎性细胞灶性浸润;PDTC 组病理改变程度介于上述两组之间,见图2。

A:对照组;B:T1DN 组;C:PDTC 组;1:胰腺 2:肾脏

2.5 VEGF、PEDF因子的表达

与对照组相比,T1DN 组、PDTC组小鼠的肾组织中VEGF平均光密度值表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),与T1DN组相比,PDTC组肾组织中 VEGF的平均光密度值表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,T1DN组和PDTC组肾组织中PEDF平均光密度值表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),与T1DN组对比,PDTC组肾组织中PEDF平均光密度值表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),见表4。

表4 各组小鼠VEGF、PEDF平均光密度值对比

3 讨论

3.1 在本研究中,4周后T1DN组、PDTC组小鼠体质量下降、BUN、Cr、血清胰岛素水平及β细胞功能指数明显降低,空腹血糖及HbAlc增高,差异有统计学意义(P<0.05);与T1DN组比较,PDTC组小鼠体质量相对增加,BUN、Cr、血清胰岛素水平及β细胞功能指数升高,空腹血糖及HbAlc降低,差异有统计学意义(P<0.05),与既往文献相符[11,12]。T1DN组胰岛萎缩,胰岛数量明显减少,体积变小,肾小管上皮细胞肿胀,胞浆疏松淡染,肾小管上皮细胞核肿大,肾小球毛细血管丛清晰,PDTC改变轻于T1DN组。T1DN组VEGF平均光密度值升高,PEDF下降;而PDTC组VEGF平均光密度值下降,PEDF表达升高,提示在糖尿病肾病发生发展过程中,PDTC改变了VEGF、PEDF因子平均光密度值的表达,从而改变了胰腺和肾脏的病理结构,这对延缓糖尿病肾病的发展可能有一定的影响。

3.2 考虑本研究因条件有限,导致研究样本量以及考察指标有限,以一个单一的小鼠模型来概括1型糖尿病肾病所有的特性是一个有待研究的方向。PDTC是否在糖尿病早期应用来延缓糖尿病肾病的发生发展,以及其副作用所带来的其他脏器的损伤,仍有待大量样本研究实验。接下来有必要将小鼠种类、特征、检测指标如血脂,胱抑素C等更多的因素考虑到研究中去,并从基因层面进一步验证PDTC的作用机制。

3.3 目前为止PDTC在各方面都有应用[13],包括医学、合成、农业等方面。其中,在医学中的使用就被调查了数年。PDTC作为一种具有抗炎、抗氧化特性的二硫代氨基甲酯化合物(dithiocarbamate compound),其在溶液中生理pH值的稳定性及穿透细胞膜的能力,且PDTC可以干扰促炎细胞因子的产生,抑制核因子kappa B从而调节血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)的表达,在这次实验中也得到了相应的数据支持。此外很多证据表明PDTC在抗癌、抗病毒,尤其用来改变登革热病毒细胞的发病机制及治疗艾滋病毒、修复肺部损伤的方面取得了相应的进展,在未来的应用中前景较好。

3.4 根据本研究的结果表明,PDTC通过改变VEGF、PEDF因子的表达情况,对糖尿病肾脏进一步的损伤可能起到了一定的保护作用,从而延缓了肾病并发症的发展,但PDTC在糖尿病肾病中发挥作用的机制及其副作用带来的损伤,未来对效果的评估仍需进一步的探究。在实验中值得注意的是,随着小鼠周龄的增长及发育的成熟,不同阶段的血生化等相关的检查指标可能存在一定的差异,但目前尚未得到有效报道。