五味苦参肠溶胶囊对DSS诱导小鼠模型TLR4/MYD88通路表达的影响研究

甘旭颖,姜 威,韩宇鹏,陈 刚,陈 曦,张瑞洲

(佳木斯大学附属第一医院,黑龙江 佳木斯 154003)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是表现为一种局限于大肠黏膜的特发性复发性炎症性疾病[1,2]。以黏膜溃疡为特征,常见临床表现为血性排便和腹痛[1]。在过去20年中,UC的发病率在全球范围内不断增加,尤其是在中国[3]。发病受环境、基因、免疫反应等多因素影响[4],可见UC 发病为多重因素相互作用同时致病的结果,因此病情复杂、复发率高、临床治疗难度大[5,6]。本研究所用五味苦参肠溶胶囊(five-flavor sophora flavescens enteric-coated capsules,FSEC)为仝战旗老师及其团队研制的一种治疗UC的国家新药,疗效并不差于氨基水杨酸制剂[7]。故本实验探讨五味苦参肠溶胶囊治疗UC的疗效及作用机制,为其实际临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只健康成年雄性C57BL/6小鼠,体质量30～32g,由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。

1.2 试剂与仪器

葡聚糖硫酸钠(DSS)(美国MP公司),Hotstart HiTaq 两步法逆转录试剂 、TRIzol(生工生物上海),PCR仪(美国应用生物),荧光定量PCR管(赛默飞),Gel-Green染料(碧云天),DNAmaker(庄盟),6*loading Buffer(takara),光学显微镜 (日本奥林巴斯)。

1.3 实验分组及造模

C57BL/6小鼠30只,随机分为对照组、模型组、治疗组,各组10只。模型组、治疗组小鼠自由饮用3%葡聚糖硫酸钠溶液7d造模,对照组正常喂养7d。造模成功后治疗组的10只小鼠,用3.84g/(kg·d)中等浓度的五味苦参肠溶胶囊溶液灌肠7d;模型组的10只小鼠分别进行等容量的0.9%氯化钠灌肠7d后;对照组正常喂养7d。

1.4 小鼠一般状况观察

逐日监测小鼠的临床症状及体征,观察小鼠的表现,进行疾病活动指数(DAI)评估[8]。

1.5 实时聚合酶链反应(rt-PCR)检测结肠组织的表达

取各组小鼠结肠组织50mg,1000μL TRIzol提取全细胞总RNA,在无菌的 RNase-free 的离心管中配制下列反转录体系I。

TLR4上游:5TGAATCCCTGCATAGAGGTA3,下游: 5GACCGTTCTGTCATGGAAGG3

MyD88 上游:5TACAAAGCAATGAAGAAGGA3,下游:5TTGCATGAGGTAGTGGCACG3

总RNA 2μg

引物 1μL

dNTP Mix(10 mM) 1μL

RNase free ddH2O 6μL

65℃保温5min后迅速在冰上冷击2min,离心30s使模板 RNA/引物的变性溶液聚集于离心管底部。

在新无菌的RNase-free的离心管中配制下列反转录体系II。

Super M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL

5X HS HiTaq One-Step RT-PCR buffer 4μL

Solution I 2μL

RNase Inhibitor(40 U/μL) 1μL

RNase free dH2O 2μL

将体系II加入到反应后的体系I中,进行第一链合成。轻弹离心管,在37℃保温60min, 80℃保温 10min后冰上冷却,得到的cDNA在-20℃保存。

PCR扩增配制以下体系

Hotstart HiTaq DNA Polymerase 1.2μL

5X HS HiTaq Buffer(Mg2+Plus) 10μL

dNTP Mix(10mM) 1μL

Solution I 5μL

cDNA 15μL

ddH2O 17.8μL

反应条件:95℃,10 min。采用2-ΔΔCT表示的相对表达水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS25.0软件进行正态分布,单因素方差分析,以及独立样本t检验法。

2 结果

2.1 各组小鼠临床症状及体征

对照组:小鼠饮食及活动正常,体质量逐渐增加,无排稀便、无便血、大便隐血试验均阴性,皮毛洁白光滑亮泽,无毛发稀疏或杂乱现象;模型组:造模第5天,小鼠多动好动,全身可见打斗痕迹,造模第7天,小鼠饮食及活动减少,出现排带血稀便,大便隐血试验出现阳性,体质量下降,毛发光泽度下降低,略显杂乱,精神不佳。第14天,小鼠饮食及活动明显减少,体质量下降明显,肛周可见明显粪便沾黏,粪质稀水样,全身各部位均有沾染,肉眼可见血便,大便隐血试验均阳性,聚团休息;治疗组:小鼠给予3.84g/(kg·d)中等浓度的五味苦参肠溶胶囊溶液灌肠治疗后,小鼠上述症状均减轻,活动及饮食逐渐恢复,排便逐渐成型,血便逐渐减少至消失。

2.2 各组小鼠组织中TLR4、MYD88mRNA的相对表达量

模型组TLR4、MYD88mRNA的相对表达量水平均高于对照组(P<0.05),且治疗组TLR4、MYD88mRNA的相对表达量水平低于模型组(P<0.05),见表1,图1。

图1 各组小鼠组织中TLR4、MYD88mRNA的相对表达量

表1 各组小鼠组织中TLR4、MYD88mRNA的相对表达量

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性终身疾病,其特征是复发缓解过程[9]。目前,没有专门许可的药物用于治疗UC。临床治疗主要包括氨基水杨酸盐、免疫调节剂、皮质类固醇、抗TNF-α药物、手术和饮食治疗。然而,由于临床疗效和潜在毒性的限制,这些药物取得的疗效有限[10]。因此,进一步寻找更有效、毒性更小的药物对治疗UC具有重要意义。Toll样受体(TLR)是一种跨膜蛋白,用于天然免疫防御[11]。TLR激活先天免疫应答,引起细胞因子释放,上调共刺激分子的表达,并通过识别医源微生物的脂多糖、脂蛋白和遗传物质核酸,为获得性免疫应答提供必要的激活信号[12]。TLR4是TLRs系列中的一个关键元素。MyD88位于染色体3p22上,My D88 碳端 TIR区域与TLR4的TIR区域相结合,而My D88的氮端是无意区域,与 NF-κB 的无意区域相结合,使得肠道黏膜免疫反应进而引起UC[13],最近一项研究证实,位于MyD88 3'-UTR的rs7744次要等位基因变异与UC易感性显著相关,尤其是在日本男性受试者中。这种多态性也可能与UC治疗反应有关[14]。TLR4的激活启动MyD88的激活,MyD88是TLR信号传导所必需的重要衔接分子。二者相互作用触发该通路下游NF-κB信号通路的和促进炎症细胞因子的合成,包括促进IBD发展的IL-6、IL-1β和TNF-α[15]。此外,NF-κB在破坏上皮屏障功能以及黏膜免疫系统和肠道微生物群之间的相互作用中也起着至关重要的作用[16]。TLR4/MyD88异常激活导致肠道炎症持续恶化,并成为UC患者药物治疗的目标[17]。

本实验结果显示与模型组相比FSEC可使治疗组TLR4、MYD88水平下降,可证FSEC对UC的治疗作用可能与下调TLR4、MYD88的mRNA表达水平有关,FSEC治疗UC有一定的治疗作用。