火针对膝骨关节炎大鼠关节软骨细胞自噬相关蛋白LC3及血清炎症因子的影响

高仰来 冯鹏 李晓霞

【摘 要】目的：觀察火针对膝骨关节炎大鼠膝关节软骨细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）及血清炎症因子的影响。方法：将36只健康SD大鼠随机分为空白对照组（8只）和造模组（28只），采用改良Hulth法制备膝骨关节炎模型，6周后随机选取造模组4只大鼠处死，行关节软骨病理学检查判定模型制备是否成功，随后将剩余24只大鼠随机分为模型对照组、西药组、火针组，每组8只。火针组给予火针治疗干预，每周2次；西药组给予盐酸氨基葡萄糖片溶液1.6 mL（0.384 mg）灌胃，每日1次；空白对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃，每日1次。各组均以4周为1个疗程。1个疗程结束后，采集各组大鼠血清、关节软骨，采用ELISA法、PCR法对血清标本的基质金属蛋白酶（MMP）-1、MMP-3、MMP-13、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、LC3水平进行检测；HE染色法观察关节软骨组织形态结构。结果：与空白对照组比较，模型对照组、西药组、火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达升高（P < 0.05），LC3表达降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达降低（P < 0.05），LC3表达升高（P < 0.05）；与西药组比较，火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达降低（P < 0.05），LC3表达升高（P < 0.05）。关节软骨病理切片显示，火针组关节腔隙明显，软骨表面毛糙，滑膜组织有少量破损，炎性细胞浸润但少于模型对照组，部分潮线破坏，软骨细胞排列尚均匀。结论：火针可降低血清炎性因子含量，上调自噬标志性蛋白LC3的表达，抑制膝骨关节炎炎症反应，缓解炎性浸润，减轻软骨细胞的破坏，改善其病理状态。

【关键词】 膝骨关节炎；火针；自噬；微管相关蛋白1轻链3；炎症因子；大鼠

The Effect of Fire Acupuncture on Autophagy Related Protein LC3 and Serum Inflammatory Factors in Joint Chondrocytes of Rats with Knee Osteoarthritis

GAO Yang-lai，FENG Peng，LI Xiao-xia

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of fire acupuncture on autophagy related protein LC3 and serum inflammatory factors in knee joint chondrocytes of rats with knee osteoarthritis.Methods：Thirty-six healthy

SD rats were randomly divided into a blank control group（8 rats）and a modeling group（28 rats）.Knee osteoarthritis models were prepared using the improved Hulth method.After 6 weeks，4 rats in the modeling group were randomly selected and killed.Joint cartilage pathology examination was performed to determine whether the model was successful.Subsequently，the remaining 24 rats were randomly divided into a model control group，a Western medicine group，and a fire acupuncture group，with eight rats in each group.The fire acupuncture group received fire acupuncture treatment intervention，twice a week;the western medicine group was given 1.6mL（0.384 mg）of glucosamine hydrochloride tablet solution by gavage，once a day;the blank control group and the model control group were given an equal amount of physiological saline by gavage，once a day.

A treatment course of four weeks was for each group.After one course of treatment，collect serum and articular cartilage from rats in each group，and use ELISA and PCR methods to detect the levels of MMP-1，MMP-3，MMP-13，TNF-α，

IL-1β and LC3;HE staining method was used to observe the morphology and structure of articular cartilage tissue.Results：Compared with the blank control group，the expressions of MMP-1，MMP-3，MMP-13，TNF-α and IL-1β in the model control group，the western medicine group and the fire acupuncture group increased（P < 0.05），while the expression of LC3 decreased（P < 0.05）;compared with the model control group，the expressions of MMP-1，

MMP-3，MMP-13，TNF-α and IL-1β in the fire acupuncture group decreased（P < 0.05），while the expression of LC3 increased（P < 0.05）;compared with the western medicine group，the expressions of MMP-1，MMP-3，

MMP-13，TNF-α and IL-1β in the fire acupuncture group decreased（P < 0.05），while the expression of LC3 increased

（P < 0.05）.Pathological sections of articular cartilage showed that in the fire acupuncture group，the joint cavity was obvious，the surface of the cartilage was rough，there was a small amount of damage to synovial tissue，inflammatory cell infiltration was less than that in the model control group，some tidal lines were damaged，and the arrangement of chondrocytes was still uniform.Conclusion：Fire acupuncture can reduce the content of serum inflammatory factors，upregulate the expression of autophagy marker protein LC3，inhibit the inflammatory response of knee osteoarthritis，alleviate inflammatory infiltration and chondrocyte damage，and improve the pathological state.

【Keywords】 knee osteoarthritis;fire acupuncture;autophagy;LC3;inflammatory factors;rats

膝骨關节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以关节软骨退变和慢性炎症为主要特点的骨关节病，临床上以膝关节疼痛、僵硬、肿大伴膝关节功能障碍为主要症状。KOA的形成机制复杂，目前国际上普遍认为KOA的主要病理改变是细胞外基质过度降解，引起软骨成分进行性丢失，造成软骨结构破坏，最终引起膝关节功能障碍。这一病理改变的关键因素是炎性因子与软骨细胞膜上相应的受体结合，激活了自噬、炎症等信号通路，致使细胞的降解大于合成，加速了关节软骨的退变。课题组应用火针治疗KOA 10余年，取得了较好的临床疗

效［1-2］。为进一步探讨火针治疗KOA的机理，课题组依据多年临床经验及有关针刺治疗KOA选穴文献［3-4］，选取经脉以足阳明胃经、足太阴脾经为主，穴位以血海、梁丘、足三里、阴陵泉为主，采用火针干预KOA大鼠模型进行实验研究，观察火针对KOA大鼠血清白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、基质金属蛋白酶（MMP）-1、

MMP-3、MMP-13、自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3（LC3）表达水平以及关节软骨损伤

情况。

1 实验材料

1.1 实验动物 4周龄雄性SD大鼠36只，体质量（200±20）g，购自中国农业科学院兰州兽医研究所，实验动物生产许可证号SCXK（甘）2015-0001。动物实验方案通过甘肃中医药大学实验动物伦理审查委员会批准（批准号2020-312）。实验动物单只分笼饲养，动物房温度设定为（23±3）℃，保持相对湿度（60±5）%。

1.2 火针及实验药品 火针采用华佗牌一次性无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，规格

0.35 mm×25 mm）。硫酸氨基葡萄糖片（新兴同仁药业有限公司，批号190901，规格0.314 g）。

1.3 实验试剂 ELISA试剂盒（江苏麦莎实业有限公司，批号Jul2021）；SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（Accurate Biotechnology，批号A3A1983）；RNAex Pro RNA提取试剂（Accurate Biotechnology，批号A3A2161）；Evo M-MLV反转录预混型试剂盒（Accurate Biotechnology，批号A3A1403）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20191104）。

1.4 实验仪器 酶标仪（美国BIO-RAD公司，

型号iMark）；高速低温台式离心机（德国Eppendorf，型号TGL-16）；NanoDrop核酸浓度测量仪（美国Thermo公司，型号ND-ONE-W）；实时定量PCR仪（美国Thermo公司，型号StepOne Plus）；切片机（德国徕卡公司，型号RM2016）；显微镜（德国徕卡公司，型号DM2500）。

2 方 法

2.1 分组及模型制备 将36只健康SD雄性大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白对照组8只和造模组28只。采用改良Hulth法［5］制备KOA模型，为防止手术切口感染，造模组大鼠术后3 d内皮下注射青霉素20万单位。伤口愈合后每日驱赶大鼠活动半小时，共计驱赶6周。6周后随机选取造模组4只大鼠处死，行关节软骨病理学检查，结果显示典型软骨退变时判定模型制作成功，随后将造模组剩余24只大鼠随机分为模型对照组、西药组、火针组，每组8只。

2.2 干预方法 火针组取血海、梁丘、足三里、阴陵泉四穴，大鼠穴位参考文献［6］，给予火针治疗干预，每周2次；西药组给予0.24 mg·mL-1盐酸氨基葡萄糖片溶液1.6 mL（0.384 mg）灌胃，每日1次；空白对照组、模型对照组给予等量生理盐水灌胃，每日１次。各组均以4周为1个疗程。

2.3 标本采集 干预4周结束后，对所有实验大鼠进行心脏采血，室温下离心机以3000 r·min-1离心15 min，离心半径7.5 cm，取血清，待测。用咬骨钳剪断大鼠右侧下肢股骨中上1/3部，分离出下肢，剔除膝关节周围肌肉组织，分离出胫股平台后暴露出关节面，关节面上下各1.5 cm截骨，获取膝关节组织标本，置于-80 ℃冰箱保存待测。每组大鼠统一随机选取4只右侧膝关节用于形态学观察，将切取股骨下1/3部放入含10%中性甲醛的固定液中固定48 h。随后采用10%EDTA脱钙剂充分脱钙，待组织完全脱钙并冲洗干净后，切出股骨内侧髁软骨并修切为约2 mm×3 mm×4 mm大小，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，

待检。

2.4 酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清

MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3含量 采用ELISA法测定，严格按照试剂说明书步骤，检测各组大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3的含量。

2.5 逆转录荧光实时定量（PCR）法检测血清MMP-1、MMP-3、MMP-13 、TNF-α、IL-1β、LC3 mRNA水平 取大鼠离心血清提取RNA，测定其纯度和浓度（紫外分光光度计），用RNA逆转录试剂盒进行反转录，合成第一链cDNA。qPCR反应条件：95 ℃ 5 min预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40个循环。所有PCR均做3个复孔，重复3次，结果以2-△△CT表示。PCR引物序列见表1。

2.6 膝关节组织标本病理学检测 采用HE染色观察各组大鼠膝关节软骨形态学改变，采用Mankin's评分方法定量分析软骨损伤情况。

2.7 统计学方法 采用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3水平比较 与空白对照组比较，模型对照组、西药组、火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达升高（P < 0.05），LC3表达降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，西药组、火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β表达降低（P < 0.05），LC3表达升高（P < 0.05）；与西药组比较，火针组MMP-13表达降低（P < 0.05），TNF-α、LC3表达升高（P < 0.05）。见表2。

3.2 各组大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β、LC3 mRNA水平比较 与空白对照组比较，模型对照组、西药组、火针组大鼠血清中MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达量升高（P < 0.05），LC3 mRNA相对表达量降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，西药组、火针组MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β mRNA相对表达量降低（P < 0.05），LC3表达升高（P < 0.05）；与西药组比较，火针组MMP-13 mRNA相对表达量降低（P < 0.05）。见表3。

3.3 各组大鼠膝关节组织病理学检测 HE染色结果显示，空白对照组大鼠膝关节软骨基质为粉红色，细胞核为深蓝色，软骨细胞排列均匀，潮线结构完整，关节腔隙清晰可见，关节腔两面滑膜软骨结构光滑、层次分明，关节腔无炎性细胞浸润，关节两端骨组织致密；模型对照组关节腔隙明显变窄，软骨面有大面积缺损，滑膜组织及软骨组织增生严重，软骨细胞排列紊乱，并有软骨和骨组织破损，潮线大量破坏，软骨和滑膜组织内有炎性细胞分布；火针组关节腔隙明显，软骨细胞排列尚均匀，软骨表面毛糙，有少量破损，炎性细胞浸润但少于模型对照组，潮线结构有部分破损。见图2。Mankin's评分结果显示，模型对照组与火针组评分高于空白对照组（P < 0.01），模型对照组评分高于火针组

（P < 0.01）。

4 讨 论

KOA属中医学“膝痛”“骨痹”等范畴。其病因较为复杂，多因长期劳损或年老体衰，致肝肾不足、筋脉关节失养，感受风寒湿热等外邪，造成关节失利、筋络痹阻、气血瘀滞，引起膝关节肿胀疼痛，活动受限等一系列症状。研究发现，多种炎性因子在KOA发病的多个环节中起关键作用，其中IL-1β、IL-6、TNF-α是导致关节软骨炎症反应的始动因素［7］，炎性因子与软骨表面受体结合，从而激活软骨细胞中核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，诱导关节软骨释放MMPs，破坏软骨细胞外基质的合成与空间正常结构。自噬可以通过消除活动期炎症细胞抑制炎症反应，阻断自噬导致内源性炎症激活剂释放而激活炎症发生［8-9］，由此可见，自噬对炎症有一定的抑制作用，是維持和平衡软骨细胞内环境的保护机制，在改善KOA的病理过程中发挥着重要作用［10-11］。

火针古代称为燔针、淬针、烧针等，将针、温热巧妙汇于一体，具备针与灸双重作用，具有温通经脉、祛寒除湿、通络止痛的功效，临床上对骨关节疾病有较好疗效。但火针较普通毫针操作技术难度和风险大，患者易产生恐惧感，应用范围没有毫针广泛。

本研究以局部选穴为原则，配伍膝关节局部穴位血海、梁丘、足三里、阴陵泉，使用火针对KOA大鼠进行干预。研究发现，火针干预KOA大鼠后，血清MMP-1、MMP-3、MMP-13、TNF-α、IL-1β的表达均低于模型对照组（P < 0.05），说明火针可降低血清炎性因子含量，抑制KOA炎症反应；血清LC3的表达高于模型对照组（P < 0.05），说明火针干预可以上调自噬标志性蛋白LC3的表达，增加软骨细胞自噬水平，减轻软骨细胞破坏，减缓KOA的发生、发展；病理学结果显示，膝关节软骨面破坏较轻、软骨缺失程度较少，炎性细胞浸润程度少，说明火针干预可以缓解炎性浸润，减轻软骨细胞的破坏。

本研究结果显示，火针干预可降低KOA大鼠血清MMP-1、MMP-3、MMP-13的表达，减少TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌，上调自噬标志性蛋白LC3的表达，抑制KOA炎症反应，增加软骨细胞自噬的水平，缓解炎性浸润，减轻软骨细胞的破坏，改善其病理状态，减缓KOA的发展。

参考文献

［1］ 高仰来，姚军汉，郭军雄.火针刺骨法配合拔罐推拿综合治疗膝关节骨性关节炎的临床观察［J］.中国针灸，2013，33（8）：697-699.

［2］ 高仰来.火针刺骨法治疗骨关节疾病临床应用体

会［J］.上海中医药杂志，2017，51（3）：64-65.

［3］ 陈丽萍，保琼楠，赵凌，等.基于健康受试者的膝关节相关腧穴痛阈量化的观察研究［J］.世界科学技术-中医药现代化，2020，22（6）：2029-2034.

［4］ 王瑞涵，薛平聚，邢海娇，等.针灸治疗膝骨性关节炎腧穴配伍规律的复杂网络分析［J］.针刺研究，2022，47（1）：65-70，87.

［5］ 李书博，陈赫，孙云，等.膝骨关节炎实验动物模型现状研究进展［J］.长春中医药大学学报，2022，38（8）：936-940.

［6］ 中国针灸学会.实验动物常用穴位名称与定位第2部分：大鼠［J］.针刺研究，2021，46（4）：351-352.

［7］ 桂苗，施珊妮，黄泽灵，等.阳虚寒凝型兔膝骨关节炎模型建立初探［J］.福建中医药，2022，53（8）：32-34.

［8］ CASTROGIOVANNI P，RAVALLI S，MUSUMECI G.Apoptosis and autophagy in the pathogenesis of osteoarthritis［J］.J Invest Surg，2020，33（9）：874-875.

［9］ 王浩，陈群超，殷丽丽.自噬在骨关节炎软骨细胞退变中表达的研究［J］.风湿病与关节炎，2021，10（4）：1-4，31.

［10］ 修忠标，刘洪，张良志，等.针刀干预对膝骨关节炎兔原代软骨细胞活性、凋亡及自噬的影响［J］.中国医药导报，2022，19（18）：123-127.

［11］ 周建华，李溟，王莉莉.自噬參与调控骨改建的研究进展［J］.中国医药导刊，2021，23（10）：730-735.

收稿日期：2023-04-15；修回日期：2023-05-27