鸽乳中产角蛋白酶菌株分离鉴定及酶学特征研究

王留兄，郑明德，梅茹，李璐璐，季海波，龚道清*，谢鹏*

(1. 扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225125；2. 淮阴师范学院生命科学学院，江苏 淮安 223001；3. 淮安正昌饲料有限公司，江苏 淮安 223001)

鸽属晚成鸟类，刚出壳的幼鸽不具备觅食能力，只能依赖亲鸽嗉囊形成的鸽乳来维持生长发育[1]。在催乳素和局部因子的作用下，亲鸽嗉囊上皮细胞快速增殖并积累营养物质，最终从组织脱落形成鸽乳[2-5]。鸽乳营养成分十分复杂，包括蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质、免疫球蛋白以及促生长因子等[6-9]。Shao等[10]对早期鸽乳进行蛋白组学分析，总共鉴定出2 558个蛋白，其中包括核糖体蛋白、角蛋白、过氧化氢酶、膜联蛋白、热休克蛋白和真核翻译蛋白等，归一化光谱丰度因素(NSAFs)法计算结果表明角蛋白约占鸽乳蛋白总量的3.52%。据报道，鸽乳中角蛋白种类繁多，其中角蛋白4(K4)的含量最高且角蛋白相关基因表达在不同时期呈现出动态变化[11]。此外，研究表明，鸽乳中含有多种微生物，包括：乳酸菌、链球菌和大肠杆菌等[12]。朱建国等[13]也从鸽乳中分离出了产纤维素酶和脂肪酶微生物。由于早期动物消化道形态及功能尚未发育完全，宿主的消化功能可通过产酶微生物来改善[14]。因此，我们推测鸽乳中可能存在相关的产角蛋白酶微生物以辅助幼鸽消化鸽乳中的角蛋白。

角蛋白酶在动物饲料、生物肥料、洗涤工业、皮革和纺织工业等方面有着广泛的应用[15]。例如，在含有羽毛粉的动物饲料中添加角蛋白酶，能够有效提高饲料中的组氨酸、甲硫氨酸和赖氨酸的生物利用率[16]。用产角蛋白酶菌株处理鸡毛，发现能够产生甲烷气体，在厌氧条件下将羽毛水解物与稀释的猪粪进一步消化，此时产生的甲烷气体比单独用猪粪发酵所产生的气体更多，这对于保护环境、解决能源短缺具有重要意义[17]。产角蛋白酶菌株来源多，马骁骁[18]从不同地区的羊圈或猪圈土壤样品中筛选出对牛毛角蛋白具有较强降解作用的野生菌，根据基因序列分析和形态学观察判定其为枯草芽胞杆菌。范佳钰等[19]从5个不同省份的鸡圈、羊圈和牛圈的土壤中筛选出1株肠杆菌，其能够高效降解羊毛角蛋白。目前大多研究集中于对毛发角蛋白的降解，并评估其产酶能力，而对于分解皮革角蛋白微生物的分离鉴定以及其产酶能力的研究甚少。本试验将采集哺育期的鸽乳样品，旨在通过富集培养、初筛、复筛以及发酵培养，以期筛选出鸽乳中产角蛋白酶微生物并对其产物进行初步酶学特征研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验样品

鸽乳采于徐州鲲鹏肉鸽养殖场，猪皮、羊皮以及鸡皮购于淮安市某菜市场。

1.1.2 培养基

富集培养基：取1 g葡萄糖，0.3 g牛肉膏，1 g蛋白胨以及0.5 g NaCl溶于100 mL纯水中，pH自然。

筛选培养基：取3.5 g猪皮粉，7 g葡萄糖，7 g琼脂，0.175 g K2HPO4，0.035 g MgSO4，0.175 g NaCl以及0.42 g KH2PO4溶于350 mL纯水中，pH自然。

摇瓶发酵培养基：取2 g葡萄糖，0.05 g NaCl，0.042 g MgSO4·7H2O，0.07 g KH2PO4和0.209 g K2HPO4·3H2O，溶于100 mL纯水中，pH自然。

LB固体培养基：取2 g胰蛋白胨，1 g酵母提取物，2 g NaCl和3 g琼脂粉，溶于200 mL纯水中，pH自然。

种子培养基：取1 g蛋白胨，0.5 g NaCl和0.5 g牛肉膏溶于100 mL纯水中，pH自然。

液体发酵培养基：取0.5 g猪皮粉，0.3 g NaCl，0.03 g CaCl2，0.03 g MgSO4，0.07 g K2HPO4，0.02 g KH2PO4以及0.3 g可溶性淀粉，溶于60 mL纯水中，pH自然。

保藏培养基：取0.3 g牛肉膏，1 g蛋白胨和1.5 g琼脂溶于100 mL纯水中，pH自然。

以上培养基均于121 ℃条件下高压灭菌30 min。

1.2 样品采集与处理

选择3日龄健康乳鸽，用手术刀在消毒后的乳鸽嗉囊上小心地切开采集鸽乳，将伤口消毒后立即用双缝线缝合上[20]。取鸽乳样品5 g，加入盛有45 mL无菌生理盐水的三角瓶中，于摇床中150 r/min振荡1 h，使得鸽乳与生理盐水均匀混合，振荡结束后静置15 min，上层液体备用待测。

取新鲜猪皮、羊皮和鸡皮，去除皮下脂肪部分，用水洗净后用剪刀剪成小块状，放入烘干箱于70 ℃烘干，利用索氏提取法反复去除油脂，部分用粉碎机将其磨成粉末，过60目筛密封保存，其余整块保存。

1.3 产角蛋白酶微生物的初筛、复筛及发酵

利用筛选培养基对产角蛋白酶菌株进行筛选，根据菌落周围是否出现透明圈来判断其是否为产角蛋白酶的菌种，透明圈的大小代表菌的产酶能力高低。吸取4 mL样品制备液，无菌接种到含有100 mL富集培养基的三角瓶中，37 ℃恒温摇床中培养24 h，期间观察微生物的富集程度，稀释涂布于筛选培养基，37 ℃恒温培养，并观察菌落的生长情况。

选取透明圈较为明显的菌株进行复筛，于筛选培养基进行划线培养2～3次，挑选单菌落，一半接种于保藏培养基进行斜面保种，另一半则于筛选培养基继续划线并使其传代5次以上。挑取经复筛分离的单菌落于揺瓶发酵培养基中，180 r/min，37 ℃震荡培养48 h，测定产酶活性并进行16S rDNA测序鉴定。

1.4 角蛋白酶活力的测定

酶活力测定参照Gradisar等[21]的方法并作调整。取2 mL Tris-HCl缓冲溶液，依次加入20 mg水解角蛋白底物和1 mL稀释的粗酶液，于50 ℃恒温水浴反应50 min，每15 min振荡1次，最后加入2 mL 10%三氯乙酸(TCA)溶液终止反应。将反应液4 ℃ 8 000 r/min离心15 min，取上清液于波长280 nm处测定吸光度。

对照试验：在1 mL粗酶液中先加入2 mL 10%TCA溶液，再加入2 mL Tris-HCl缓冲溶液。其余步骤同上。

一个酶活单位(1 U)定义为：在波长280 nm下，试验组比对照组每高出0.01吸光值便计为1 U。重复测量3次取平均值，计算公式如下所示：

角蛋白酶活力=5n×ΔA280/(0.01×50)。

样品角蛋白酶活力单位为U·mL-1，ΔA280为试验组280 nm处的吸光度-对照组280 nm处的吸光度。n为粗酶液的稀释倍数，5为终反应体积(mL)，50为反应时间(min)。

1.5 菌落分子鉴定

提取所筛菌株的基因组DNA并扩增其16S rDNA，回收纯化PCR产物并由南京金斯瑞公司测序，测序结果经NCBI进行BLAST比对得出所筛菌株的类型。采用引物为，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.6 角蛋白酶酶学特征研究

1.6.1 制备种子液

将保存菌种取出解冻，各取100 μL菌液涂布LB固体培养基，30 ℃恒温培养箱中培养24 h并进行观察，划线传代2次，分别挑取单菌落于100 mL种子培养基中，37 ℃，180 r/min培养36 h，即制成种子液。

1.6.2 粗酶液制备

种子液2 mL，加入到60 mL液体发酵培养基中去，于37 ℃、180 r/min摇床中培养48 h，将发酵液于4 ℃离心机中10 000 r/min离心10 min，取上清液，即为粗酶液。

1.6.3 猪皮降解率测定

将去脂去杂烘至恒重的猪皮称重后加入含2 mL种子液的液体发酵培养基中，37 ℃、180 r/min振荡培养，分别在发酵0、24、48、51、53.5、54.5和55.5 h后过滤，将剩余的猪皮残渣置于105 ℃的烘箱中烘至恒重，按照以下公式计算降解率。

降解率=(酶解前猪皮干重-酶解后猪皮干重)/酶解前猪皮干重×100%。

1.6.4 产角蛋白酶酶活测定

在发酵的第0、24、48、51、53.5、54.5和55.5小时分别取样制备粗酶液，酶活测定方法参照1.4角蛋白酶活力测定步骤。

1.6.5 角蛋白酶底物特性研究

以不同来源的角蛋白(羊皮粉、猪皮粉和鸡皮粉)作为底物，测定不同菌株所产角蛋白酶在不同底物处理下的酶活性(pH=8.8，反应温度50 ℃，反应时间50 min)，测定方法参照步骤1.4角蛋白酶活力的测定。

1.7 酶活数据分析

酶活数据结果取3个样品重复的平均值。数据采用SPSS 25.0软件进行分析，差异显著性以P<0.05表示。

2 结果

2.1 产酶菌的菌落形态观察

在筛选培养基上发现有透明圈且生长良好的目标菌落，通过复筛，最终挑选了3种菌落形态的目的菌株，分别编号为KPB-1、KPB-2、KPB-3。如图1所示：KPB-1的菌落四周呈绒毛状，菌落黄色；KPB-2单菌落形状为圆形，呈淡黄色；KPB-3单菌落形状为圆形，较小，呈淡黄色。

2.2 菌株产角蛋白酶酶活力

将筛选出的3个菌株(KPB-1、KPB-2、KPB-3)进行角蛋白酶活力测定。结果如图2所示，筛选出的3种菌株均具有较好的产酶能力，其中菌株KPB-1产角蛋白酶的活力最高。

图2 3株菌产角蛋白酶的活性

2.3 菌株16S rDNA扩增结果

扩增16S rDNA，电泳结果如图3所示，切胶回收并纯化PCR产物。

M. Marker；1. KPB-1；2. KPB-2；3. KPB-3。

2.4 产酶菌株测序结果及系统发育树分析

测序所得3种菌株的16S rDNA序列(KPB-1为1 416 bp、KPB-2为1 397 bp、KPB-3为1 383 bp)，在GenBank中作BLAST同源性检索并利用MEGA 4.0软件分析构建系统发育进化树，结果如图4所示：KPB-1和KPB-2为枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)；KPB-3为大肠杆菌(Escherichiacoli)。

注：边框为本试验分离株。

2.5 发酵过程中猪皮降解变化规律

由图5可知，3种菌种对猪皮均有降解作用，随着发酵时间增加，3种菌株对猪皮的降解率均呈上升趋势。48 h后的降解率均达到60%以上，其中降解效果依次为枯草芽胞杆菌KPB-1、大肠杆菌KPB-3、枯草芽胞杆菌KPB-2。

图5 3株菌对猪皮的降解率

2.6 发酵过程中3种菌株产角蛋白酶的酶活变化规律

由图6可知，3种菌株的酶活都随发酵时间的延长而增加。3种菌株7个不同时间点酶活大小为：枯草芽胞杆菌KPB-1>大肠杆菌KPB-3>枯草芽胞杆菌KPB-2。

图6 不同时间点酶活变化曲线

2.7 不同底物对3种菌株产角蛋白酶活性的影响

由图7可知，相较于猪皮粉和鸡皮粉，KPB-1、KPB-2和KPB-3所产角蛋白酶在降解羊皮粉中表现出更高的酶活性(P<0.05)。

注：每组不同的字母之间表示差异显著(P<0.05)。

3 讨论

研究表明，微生物在动物生长发育过程中发挥着重要的作用，不仅维持着宿主胃肠道屏障的完整性，其代谢产物还调节着机体的生长发育、营养代谢和免疫水平[22]。鸽乳是鸽嗉囊组织形成的富含营养成分的奶酪状物质，是乳鸽早期阶段唯一的营养来源[2，5]。刚出壳的幼鸽须由亲鸽饲喂，其过程必然伴随着亲鸽消化道中的相关微生物的转移[23]。由于刚出壳幼鸽肠道处于无菌状态，我们推测，鸽乳对于幼鸽肠道微生物种群的建立起着非常重要的作用[24-25]。本试验筛选出3种产角蛋白酶菌株，分别为枯草芽胞杆菌KPB-1、枯草芽胞杆菌KPB-2和大肠杆菌KPB-3。大肠杆菌根据其致病性可分为病原性和非病原性两类[14]。作为条件性致病菌，大肠杆菌能够引起鸽局部和全身性疾病[26]，但确定本试验筛选出的大肠杆菌是否为条件致病菌，还有待进一步研究。枯草芽胞杆菌种类繁多且能产生多种酶，例如，奶牛瘤胃源枯草芽胞杆菌BX1-12可产纤维素酶、蛋白酶以及α-淀粉酶[27]。本试验所筛的枯草芽胞杆菌可产角蛋白酶，但其是否可产生其他酶类还需进一步研究。

我国畜禽养殖量大，其屠宰后会产生大量的羽毛、皮革边角料等废弃物[28]。起初人们只是对这些废弃物进行简单处理，造成了蛋白资源浪费和环境污染[29]。研究者们发现上述物质的主要成分是角蛋白，若采用合适方法将会有很好的应用潜力。目前所采取的角蛋白降解方法主要有物理和化学降解法，物理降解法包括高压加热水解法和挤压膨化法，化学降解法包括酸水解法和碱水解法。物理降解法对参数设置要求较高，且实际操作中很难控制，而化学降解法不仅会造成环境污染，还会破坏角蛋白中的部分氨基酸，并在产品回收过程中产生大量的盐分[30-31]。已有研究证实，利用微生物法降解角蛋白不但具有环保、低成本等优点，而且只需通过常规优化手段提高角蛋白酶活力，就能显著提高降解效率，因此具有很大的应用前景[32]。目前人们筛选出了多种能够降解羽毛角蛋白的菌株，也探索了多种测定羽毛角蛋白酶活性的方法。胡介卿等[33]从鸬鹚肠道中分离出的枯草芽胞杆菌对羽毛角蛋白有强大分解能力；冀勇良等[21]确定了以羽毛粉为底物测定角蛋白酶活性的最佳方法。然而人们对于皮革角蛋白降解菌株的分离鉴定及其酶学特征研究少之甚少。

角蛋白按照二级结构可分为α-角蛋白和β-角蛋白，根据其含硫量又可分为软角蛋白和硬角蛋白。不同来源的角蛋白，其氨基酸组成和含量有所不同[34]，这可能是造成同一菌株对不同底物呈现出不同酶活的主要原因。本试验所筛选出的3种菌株对猪皮均具有较好的降解作用，且48 h后的降解率均超过了60%，说明这3种菌株可能在降解皮革角蛋白方面具有较好的应用前景。随着发酵时间的延长，枯草芽胞杆菌KPB-1的酶活要显著高于大肠杆菌KPB-3和枯草芽胞杆菌KPB-2。上述3种菌对羊皮、猪皮和鸡皮的降解效果不一致，其中对羊皮的降解效果最好，由此推测羊皮角蛋白的构成能够更有效诱导上述3种菌株产角蛋白酶。

4 结论

本试验分离鉴定出3种产角蛋白酶微生物，分别为1株大肠杆菌和2株枯草芽胞杆菌，3种菌株对动物皮革均有较好的降解作用。随着发酵时间的延长，3种菌株所产角蛋白酶的酶活性均呈上升趋势，且均在降解羊皮中表现出更高的酶活性。本研究为乳鸽营养物质消化机理和产角蛋白酶微生物的研究及应用奠定了基础。