新型AChE抑制剂胡椒碱衍生物对阿尔茨海默病小鼠的治疗作用评价

孙佳磊,朱仁德,吴 静,曹国敏,刘新华,李 荣,石静波

(安徽医科大学药学院,安徽 合肥 230032)

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD) 是以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经系统退行性病变,是最为常见的一种痴呆类型[1-2],也是老年期最常见的慢性疾病之一。由于AD病因复杂,目前尚缺乏有效的治疗药物。基于致病因素也提出多种假说,包括乙酰胆碱水平失衡、β-淀粉样蛋白(Aβ) 聚集、Tau蛋白假说、氧化应激和金属离子平衡失调等[3-4]。基于这些假说,目前被批准用于AD治疗的药物如:N-甲基-d-天冬氨酸(NMDA) 受体拮抗剂盐酸美金刚、靶向β淀粉样蛋白的仑卡奈单抗(Lecanemab) 和乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐等[5-6]。然而,这些药物只能改善认知和行为症状,而不能改变疾病的病程。因此,开发新的AD治疗药是非常必要的。

胡椒碱(piperine) (Fig 1) 是一种从胡椒科植物胡椒 (Piper nigrum) 中分离出来的生物碱,文献报道其具有抑制乙酰胆碱酯酶 (acetylcholinesterase,AChE) 活性、抑制β-淀粉样蛋白聚集和抑制Tau蛋白过度磷酸化,对AD具有神经保护能力[7-11]。川芎嗪(TMP)(Fig 1) 因其具有多种生物活性而被认为是药物设计中的重要骨架。本文基于胡椒碱骨架,采用片段替换法,对Aromatic片段用TMP替换,获得化合物4a (Fig 1),进一步探讨其对乙酰胆碱酯酶的抑制活性,并在AD小鼠的模型中评价其对神经保护的作用。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂化合物4a,分子式C17H23N3O,分子量285.18,来源于安徽医科大学药学院。Aβ1-42(Beyotime,107761-42-2),Phospho-Tau (Ser396)抗体(Affinity,AF3148),DTNB(Sigma,D8130-1G),东莨菪碱氢溴酸盐(阿拉丁试剂,H1507073),多奈哌齐(上海麦克林生化科技股份有限公司,120014-06-4)。

1.2 实验仪器酶标仪(MQX200,Bio-Tek),荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200),认知功能采用Morris水迷宫进行评估,使用的计算机配备了分析管理系统(Viewer 2,上海吉量软件科技有限公司)。

1.3 实验动物30只雄性C57BL/6J小鼠,SPF级,体质量(18～22)g,在河南斯克贝斯生物科技股份有限公司购买,合格证号为410983231100000861,生产许可证号为SCXK (豫) 2020-0005,分笼喂养于安徽医科大学实验动物中心,动物使用许可证号SYXK (皖) 2020-001。

Fig 1 The design idea of compound 4a

1.4 方法

1.4.1抑制乙酰胆碱酯酶的活性测定 采用 Ellman′s 法测试化合物抑制乙酰胆碱酯酶的活性。实验在48孔板中进行,最终体积为500 μL。每口孔中含有0.036 kU·L-1的EeAChE和0.1 mol·L-1的pH8磷酸盐缓冲液。在37 ℃下,不同浓度化合物预孵育20 min,然后加入0.35 mmol·L-1乙酰硫胆碱碘化物和0.35 mmol·L-15,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)。DTNB在乙酰胆碱酶降解过程中产生黄色阴离子5-硫代-2-硝基苯甲酸,20 min后在410 nm处测定吸光度。半数抑制浓度值(IC50) 由抑制曲线确定,对照实验在相同条件下不添加抑制剂。

1.4.2分子对接 利用Discovery Studio软件,将化合物4a与乙酰胆碱酯酶蛋白(PDB:4EY4) 进行CDOCKER对接,通过配体与受体的结合模式,观察配体能够充分占据蛋白质的结合位点的最优构象,以系统打分值、氢键相互作用、疏水作用力等指标作为测定参数,进一步判断该化合物与乙酰胆碱酯酶蛋白的氨基酸残基之间的相互作用。

1.4.3抑制乙酰胆碱酯酶的动力学特征 动力学研究是在与上述酶抑制实验相同的试验条件下进行的。在不同时间测量不同浓度抑制剂存在下的碘代硫化乙酰胆碱,利用Lineweaver-Burk方程得到抑制模型和1/V与1/[S]的倒数图。

1.4.4对Aβ1-42多肽聚集的影响 采用硫黄素-T[Thioflavin T,(ThT)]荧光染色法分析化合物对Aβ1-42聚集的影响。Aβ1-42和化合物4a均使用磷酸盐缓冲溶液稀释至所需的浓度。将10 μL的Aβ1-42(终浓度10 μmol·L-1) 加入96孔板中,实验组加入10 μL 4a (终浓度100 μmol·L-1),对照组加入等量缓冲液,孵育48 h。然后,加入含有5 μmol·L-1ThT的50 mmol·L-1Gly-NaOH缓冲液 (pH 8.5),体积为200 mL。荧光强度用Synergy HTX荧光酶标仪测定,激发波长和发射波长分别为λex=450 nm和λex=485 nm。

1.4.5免疫蛋白印迹法 将人神经母细胞瘤细胞 (SH-SY5Y) 接种于6孔板中。当细胞长至80%时,用化合物4a预处理细胞1 h,然后用Aβ1-42(20 mmol·L-1) 孵育6 h,细胞在300 mL RIPA细胞裂解缓冲液 (含有PMSF和磷酸酶抑制剂) 中裂解,离心收集上清液。通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜。将印迹膜与一抗在4 ℃下孵育16 h后,加入1 ∶5 000二抗,室温孵育1 h,洗膜,显影。

1.4.6认知行为研究 采用Morris水迷宫(morris water maze, MWM)实验进行测试。迷宫被布置在一个明亮的25 ℃房间里。将水池 (半径60 cm,高45 cm) 分为4个象限 (Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ),在一个象限的中心放置一个平台 (半径5 cm,水下1 cm)。行为研究包括5 d的学习和记忆训练,以及第6天的对位探查训练。在训练和测试过程中,小鼠被置于面向池壁的水中。在训练过程中,每只小鼠依次从每个象限开始,分别在第1～2天通过可见平台 (用小旗标记) 和第3～5天通过隐匿平台进行评估,探索记忆的保留以寻找目标。所有小鼠每天进行两次实验,每一次实验持续60 s。如果小鼠在60 s内成功到达平台,它将被称为“成功逃避”,它的逃避潜伏期和轨迹将被记录下来。如果小鼠在60 s内无法到达平台,它将会被手动引导。到达平台后,让所有小鼠适应平台15 s。实验当日拆除或保留平台,进行对位探查训练。使用Panlab SMART 3.0记录所有小鼠的逃避潜伏期和运动轨迹。

2 结果

2.1 化合物4a抑制乙酰胆碱酯酶的活性将化合物4a进行抑制乙酰胆碱酯酶活性研究发现 (Tab 1),在200 nmol·L-1时,化合物具有良好的抑制活性,其抑制率为89.77%。进一步测定IC50值 (Tab 1) 发现化合物4a具有较好的抑制乙酰胆碱酯酶活性,IC50值为0.11 μmol·L-1。

2.2 化合物4a的分子对接化合物4a与乙酰胆碱酯酶蛋白的CDOCKER对接结果如Fig 2所示,化合物4a结构中羰基的氧原子与氨基酸残基Gly121和Gly122有较强的氢键相互作用,哌啶环与Trp86、His447存在一定的相互作用。化合物4a很好地占据活性口袋的位置,分子对接结果表明化合物4a可以与乙酰胆碱酯酶发生良好的分子间作用。

2.3 动力学研究为进一步研究其抑制机制,我们将化合物4a进行动力学研究。如Fig 3A 所示,趋势线的斜率 (Vmax) 和截距 (Km) 随着抑制剂浓度的增加而增加,并在第二象限相交,表明4a可能是乙酰胆碱酯酶的混合型抑制剂。此外,通过绘制Lineweaver-Burk二级图分析酶抑制剂复合物的解离常数(Ki,与X轴的截距)。如Fig 3B、C所示,对于AChE,4a的Ki值为0.68 μmol·L-1,对于AChE-底物复合物,Ki-s值为1.1 μmol·L-1。

2.4 对Aβ1-42聚集的影响Aβ被认为是淀粉样蛋白假说和氧化应激的核心[12-13]。由于胡椒碱可以调节Aβ1-42的折叠,因此我们随后研究了化合物4a是否能降低聚集速率。以多奈哌齐为参照的ThT荧光染色法测定溶液中Aβ1-42的聚集能力。如Tab 2所示,化合物4a明显阻止Aβ1-42肽聚集,抑制率为64.02%,高于多奈哌齐 (32.06%)。因此,化合物4a可以抑制Aβ1-42的聚集。

Fig 2 Diagram of interaction between compound 4a

Tab 2 The inhibitory rate of compound 4a for

2.5 抑制Tau蛋白过度磷酸化ROS诱导的细胞代谢异常会使Tau蛋白过度磷酸化,而Tau蛋白又会独立地加剧线粒体功能障碍和ROS生产,从而形成恶性循环[14]。为了观察化合物4a对Tau蛋白过磷酸化的影响,采用免疫蛋白印迹法检测了Aβ 诱导的SH-SY5Y细胞中Tau蛋白过磷酸化 (Ser396) 的抑制作用。如Fig 4所示,与对照组相比,SH-SY5Y细胞经20 μmol·L-1Aβ 孵育后,Tau蛋白Ser396位点的磷酸化水平升高。然而,用化合物4a (2.5、5 μmol·L-1和10 μmol·L-1) 预处理1 h后,该位点的磷酸化水平呈浓度依赖性降低。结果表明,化合物4a可以以浓度依赖性的方式抑制Tau蛋白的过度磷酸化。

Fig 3 Enzyme kinetics of compound 4a against AChE

2.6 体内生物学研究认知功能障碍的恢复是抗AD药物最必要的特性[15]。Morris水迷宫是一种经典的实验方法评估小鼠的认知能力[16]。为评价化合物4a的体内活性,采用东莨菪碱建立认知功能障碍模型[17],以多奈哌齐 (10 mg·kg-1) 作为阳性对照。将化合物4a (40和20 mg·kg-1) 和多奈哌齐小鼠口服给药30 min后,腹腔注射东莨菪碱(3 mg·kg-1),空白对照组腹腔注射等体积的生理盐水,连续10 d。小鼠寻找平台的轨迹、在目标象限的停留时间及跨越隐匿平台的次数如Fig 5所示。与对照组相比,东莨菪碱模型组出现了明显的混乱轨迹、在目标象限的停留时间短、跨越隐匿平台的次数减少,表明认知障碍小鼠模型的成功建立。在阳性对照组中,多奈哌齐可以改善认知障碍,其轨迹简化,在目标象限停留时间更长,跨越平台次数增多。此外,化合物4a的治疗可以以剂量依赖的方式显著增加在目标象限停留的时间和跨越平台的次数。40 mg·kg-1剂量的化合物4a改善认知功能效果显著,实验期间无死亡及行为异常发生。结论表明,化合物4a几乎可以使受损小鼠恢复到正常的认知能力,与多奈哌齐相当。

Fig 4 Effect of compound 4a against

Fig 5 Effect of compound 4a in MWM

3 讨论

本研究首先评价了新型胡椒碱衍生物4a对AChE的抑制活性,结果发现对AChE具有较强的抑制作用,抑制率为89.77%,IC50值为0.11 μmol·L-1,化合物4a与乙酰胆碱酯酶蛋白的CDOCKER对接结果表明,其结构中羰基的氧原子与残基Gly121和Gly122有较强的氢键相互作用且很好的占据活性口袋的位置,同时具有良好的酶动力学特征。进一步研究发现化合物4a可以抑制Aβ 蛋白的聚集,以浓度依赖性的方式抑制Tau蛋白的过度磷酸化。此外,Morris水迷宫体内实验表明该化合物能显著改善认知功能障碍小鼠的记忆和学习能力。综上所述,这将为化合物4a开发成一种潜在的AD治疗药物提供一定的依据。