维生素A调控DDR1介导的细胞自噬对孤独症大鼠神经行为学的影响

王凌啸,刘 阳,袁俊梅,张 浩,王 瑞

(1. 黄淮学院直属附属驻马店市中心医院儿童康复科, 河南 驻马店 463003;2.西安交通大学医学部药学院药理学系,陕西 西安 710061;3.西安交通大学附属儿童医院儿童保健中心, 陕西 西安 710065)

孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder,ASD)是发生于儿童发育早期的一种异质性神经发育障碍性疾病,主要表现为社会交流和交往困难、兴趣范围狭窄及重复性刻板行为,严重的影响儿童身心健康及生活质量[1]。

维生素A(vitamin A,VA)是人体必需的一种脂溶性微量营养素,在维持机体脑生长发育及稳态平衡中发挥重要作用。既往研究显示,孕期VA缺乏可导致大脑发育异常,其中VA水平与ASD临床症状表现呈显著相关性[2]。另外,幼年期VA缺乏会明显损害动物空间学习记忆能力及社交活动[3]。与正常婴幼儿相比,ASD儿童血清VA水平显著降低[4],提示VA可能与ASD疾病发生存在一定的相关性。但是,目前有关VA治疗ASD的分子机制尚不完全清楚。因此,以VA为核心的ASD药物治疗机制研究尤为重要。ASD病因机制复杂,其中突触功能障碍已成为ASD研究领域的焦点。研究发现,自噬参与ASD突触的形成及连接间的建立,在ASD大鼠模型中,自噬水平显著降低,而增强自噬能够促进神经系统中异常蛋白消除,提高海马组织兴奋性,从而改善ASD核心症状[5],提示自噬可能与ASD海马神经功能异常存在一定的相关性。盘状结构域受体1(discoid domain receptor 1,DDR1)为酪氨酸蛋白家族成员之一,参与如肿瘤、心血管、神经等疾病的发生发展[6]。研究显示,在局灶性脑缺血/再灌注损伤大鼠模型中DDR1表达升高,而抑制DDR1表达能够明显减轻脑神经损伤[7],提示DDR1可能与神经功能障碍存在一定的相关性。但是,目前有关DDR1是否参与ASD神经功能障碍无相关报道。本研究拟通过丙戊酸钠(sodium valproate acid,VPA)诱导孕鼠子代ASD模型,观察VA对ASD大鼠神经行为学的影响及可能的作用机制,以期为VA在ASD早期康复治疗中提供可靠的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1动物 成年,SPF级雌、雄Wistar大鼠各10只,体质量(200～250)g,购买于郑州大学医学院实验动物学部,生产许可证号:SCXK(豫)2018-0007,使用许可证号:SYXK(豫)2019-0013。动物实验符合3R原则,且本实验通过我院动物医学伦理委员会审查(批件号:2021LL017),放置于(24±2)℃,相对湿度为55%～65%,昼夜交替光照,自由饮食、饮水,适应性喂养1周。

1.1.2药物与试剂 VA棕榈酸酯(上海阿拉丁公司,货号:R106319-100g);VPA(美国Sigma公司,批号:1069-66-5);DDR1抑制剂(DDR1-IN-5)(美国MedchemExpress公司,货号:HY-133669);pcDNA3.1质粒(BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心);苏木素-伊红(hematoxylin eosin,HE)检测试剂盒、β-actin一抗、HRP标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG(碧云天生物技术公司,货号:C0105S、AF0003、A0412、A0408);NeuN抗体、DDR1抗体、LC3抗体、p62抗体(美国Cell Signaling Technology,货号:24307、5583、3868、88588)。

1.1.3仪器 荧光倒置显微镜(日本/奥林巴斯Olympus,型号:CKX53);高速冷冻离心机(湖南可成仪器设备有限公司,型号:H3-18KR);恒温摇床(南京威美特科学仪器有限公司,型号:LM61-HWT);凝胶成像系统(美国Bio-Rad伯乐公司,型号:Gel Doc XR+);Morris水迷宫成像系统(北京智多宝生物科技有限责任公司,型号:DB001X);透射电镜(日本电子株式会社,型号:JEM1230)。

1.2 方法

1.2.1ASD大鼠模型建立及分组处理 参照Schneider等[8]方法构建ASD大鼠模型,将雌雄大鼠按照1 ∶1比例混合,若出现阴栓则记为怀孕D1(E1),E12.5 d时大鼠腹腔注射VPA(600 mg·kg-1)构建ASD模型,对照组(Control)大鼠腹腔注射等量生理盐水。随后将ASD组孕鼠生产的子代雄性幼鼠分为:ASD组、VA组、DDR1抑制剂组(DDR1 inhibitor)以及VA+DDR1过表达质粒组(VA+OVE-DDR1),Control组孕大鼠所产子代记为正常对照组,每组各10只。子鼠出生D1记为P1,5组子鼠均从P7开始进行实验干预。VA组子鼠以50 000 U/2.5 kg的VA灌胃[9],每日1次,连续3周;DDR1 inhibitor组子鼠以5 μg DDR1-IN-5侧脑室一次性注射;VA+OVE-DDR1组子鼠给予3 μg/10 μL DDR1过表达质粒侧脑室注射的同时连续3周进行VA灌胃,其中DDR1重组质粒制备参照BioVector公司试剂盒说明书进行制备,取重组pcDNA3.1-DDR1加入至感受态细菌中进行转化,挑选单菌落培养,质粒提取,限制性内切酶酶切鉴定,由上海生工公司测序鉴,采用脂质体转染法进行。Control组子鼠给以等量大豆油灌胃。以上各组大鼠于P23时断奶,P28时进行相关实验检测。

1.2.2重复刻板行为学实验 P28时,将各组大鼠放入鼠盒中(30 cm×25 cm×20 cm),其中盒底放置1 cm厚度辅料覆盖,以阻止大鼠挖掘盒底。保持周围环境安静,适应性放置5 min,之后通过计时10 min内各组大鼠转圈、跳跃及梳理毛发的总时间,评价大鼠重复刻板行为。

1.2.3三箱实验 通过三箱实验进行大鼠社交能力检测。实验箱尺寸长×宽×高(123 cm×50 cm×40 cm)的长方体,并使用不透明玻璃板将其隔离成大小相等的三室,各室间通过隔板相连(隔板上留有大小适宜的孔洞能够保证大鼠自由通过三室)。左右两室外侧各与大鼠鼠箱相连并通过带孔挡板与左右两室相通。实验开始前将测试大鼠放置于中间室并挡住隔板孔洞适应性活动5 min,之后打开挡板,使测试大鼠自由活动5 min。实验开始前右边鼠箱中放置1只陌生大鼠,通过JLBehv动物行为分析系统统计分析各组大鼠10 min内分别与陌生鼠及空箱社交时间。

1.2.4水迷宫实验 VA给药3周后,行Morris水迷宫实验,将水迷宫划分为4个象限,并随机性选取一个象限下放置隐蔽平台,将大鼠从4个象限随机性放入水中,记录大鼠寻找到平台的时间,即为逃避潜伏期。通过上海吉量软件公司视频采集分析系统记录大鼠寻找到水下隐匿平台的时间及运动轨迹。大鼠经过5 d平台寻找训练:4个象限入水点,每天训练1次,每次间隔20 min,于5 d记录各组大鼠逃避潜伏期时间。空间探索实验:于6 d,撤去隐蔽平台,将大鼠从4个象限中任一象限随机入水,记录大鼠60 s内穿越平台的次数以及目标象限的停留时间占比。

1.2.5HE染色观察海马CA1区域形态变化 大鼠麻醉后,大鼠颈椎脱臼处死,摘取脑片(摘取视交叉至漏斗柄),组织固定、石蜡包埋、切片,行HE染色,并于200倍镜下观察海马CA1区域形态变化。半定量评估海马CA1区域神经元损伤。1级:海马CA1区域分散零散损伤神经元(<20%);2级:海马CA1区域存在少量损伤神经元(20%～40%);3级:海马CA1区域伴有中等数量损伤神经元(40%～60%);4级:海马CA1区域有大量损伤神经元(60%～80%);5级:海马CA1区域神经元存在广泛性损伤(80%～100%)。

1.2.6免疫组化检测海马CA1区域NeuN阳性细胞 海马组织切片,经内源性过氧化物酶阻断剂阻断、抗原修复、组织封闭后,滴加NeuN单克隆抗体(1 ∶500),孵育过夜,对应二抗孵育2 h,滴加DAB显色液,显微镜下观察海马神经元NeuN着色情况。

1.2.7透射电镜检测海马CA1区域自噬体数量 将大脑海马组织修剪成大小为1 mm×1 mm组织块,在1%四氧化锇中固定3 h。乙醇和丙酮梯度脱水后,将样品嵌入Spurr树脂中,并切成70 nm厚的薄片,最后采用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色,并于10 000×透射电子显微镜观察自噬小体形态与数量。

1.2.8免疫荧光检测LC3表达 快速取出大脑海马组织,20%的蔗糖溶液脱水,组织冷冻切片机切片获得厚度为10～20 μm脑片,PBS清洗脑片残留血渍,组织透化液Triton X-100透化时长约15 min,胎牛血清封闭非特异性位点30 min,滴加LC3抗体(绿色),4 ℃条件下,孵育过夜,37 ℃条件下孵育二抗60 min,PBS润洗切片,进行海马神经元NeuN细胞核染色5 min(红色),最后加载盖玻片,封片。实验结果以荧光显微镜下观察切片视野中LC3阳性细胞数与细胞总数比值反映LC3相对表达量。

1.2.9Western blot检测海马组织DDR1、LC3、p62蛋白表达 大鼠海马组织剪碎后混合加入蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液,于4 ℃条件下,裂解30 min。将离心管放置于离心机内,并设置:4 ℃,12 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液。BCA法测定蛋白质浓度,蛋白质变性,蛋白上样,电泳,分离蛋白,转膜。室温条件下PVDF采用6% BSA封闭1 h,TBST洗膜后孵育DDR1一抗、LC3一抗、p62一抗、β-actin一抗,稀释比例均为1 ∶1 000,4 ℃下孵育16 h。次日取出PVDF膜TPST洗涤后加入相应HRP标记的山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG孵育2 h。TBST洗涤3次,滴加显影液,采用ImageJ软件进行DDR1、LC3、p62蛋白表达定量。

2 结果

2.1 各组大鼠海马组织DDR1表达变化与Control组相比,Model组大鼠海马组织DDR1蛋白表达明显升高(P<0.01)。与Model组相比。VA组和DDR1 inhibitor组大鼠海马组织DDR1蛋白表达均明显降低(P<0.01)。与VA组相比,VA+OVE-DDR1组大鼠海马组织DDR1蛋白表达明显升高(P<0.01)(Fig 1)。

Fig 1 The protein of DDR1 expression in hippocampus of rats in each group

2.2 各组大鼠社交行为及重复刻板行为的变化情况旷场实验结果显示,5组大鼠移动总行程及活动时间均有显著性差异。与Control组相比,Model组大鼠移动总行程及活动时间均增加(P<0.01)。与Model组相比,VA和DDR1 inhibitor组大鼠移动总行程及活动时间均降低(P<0.05或P<0.01)。与VA组相比,VA+OVE-DDR1组大鼠移动总行程及活动时间均明显增加(P<0.05)。三箱实验检测显示,与Control组相比,Model组大鼠与陌生大鼠接触时间变短,与空箱接触时间变长(P<0.01)。与Model组相比,VA组和DDR1 inhibitor组大鼠接触时间变长,与空箱接触时间变短(P<0.05)。与VA组相比,VA+OVE-DDR1组大鼠与陌生大鼠接触时间变短,与空箱接触时间变长(P<0.05)。自梳理实验检测显示,与Control组相比,Model组大鼠重复刻板行为时间变长(P<0.01)。与Model组相比,VA组和DDR1 inhibitor组大鼠重复刻板行为时间变短(P<0.01)。与VA组相比,VA+OVE组大鼠重复刻板行为时间变长(P<0.01)(Fig 2)。

2.3 各组大鼠学习记忆能力变化情况与Control组相比,Model组大鼠逃避潜伏期时间延长,穿越目标平台次数及目标平台停留时间占比均明显降低(P<0.01)。与Model组相比,VA组和DDR1 inhibitor组大鼠逃避潜伏期时间时长降低,穿越目标平台次数及目标平台停留时间占比均明显增加(P<0.01)。

Fig 2 Comparison of social behavior and repetitive stereotype of rats in each group

与VA组相比,VA+OVE-DDR1组大鼠逃避潜伏期时间延长,穿越目标平台次数及目标平台停留时间占比均明显降低(P<0.05或P<0.01)(Fig 3)。

2.4 各组大鼠海马CA1区域神经元损伤情况HE染色显示,Control组大鼠海马CA1区域神经元排列整齐,结构完整。Model组大鼠海马CA1区域神经元排列紊乱,部分神经元细胞核固缩,嗜酸性粒细胞数目明显增多,海马神经元损伤评分增加(P<0.01)。与Model组相比,VA组和DDR1 inhibitor组大鼠海马CA1区域大部分神经元结构正常,酸性粒细胞数目明显增加减少,神经元损伤评分降低(P<0.01)。与VA组相比,VA+OVE-DDR1组大鼠海马CA1区神经元损伤较Model组相似。免疫组化检测显示,与Control组相比,Model组大鼠海马CA1区域NeuN+阳性细胞数量明显减少(P<0.01)。与Model组相比,VA组和DDR1 inhibitor组大鼠海马CA1区域NeuN+阳性细胞数量明显增多(P<0.01)。与VA组相比,VA+OVE-DDR1组大鼠海马CA1区域NeuN+阳性细胞数量明显减少(P<0.01)(Fig 4)。

2.5 各组大鼠海马神经元自噬水平比较透射电镜观察显示,海马CA1区域可见自噬小体,自噬小体形状是由细胞质成分或废弃细胞器在不同降解阶段的消化和降解形成的层状结构,包裹在单层或双层膜中,边界清晰可见。与Control组相比,Model组自噬体数量明显降低(P<0.01)。与Model组相比,VA组和DDR1 inhibitor组自噬体数量明显增加(P<0.01)。与VA组相比,VA+OVE-DDR1组噬体数量明显降低(P<0.01)(Fig 5)。

2.6 各组大鼠海马组织自噬标志蛋白表达变化与Control组相比,Model组大鼠海马CA1区神经元LC3阳性表达率及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均明显降低(P<0.01),p62表达明显升高(P<0.01)。与Model组相比,VA组和DDR1 inhibitor组大鼠海马CA1区神经元LC3阳性表达率及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均明显升高(P<0.01),p62表达明显降低(P<0.01)。与VA组相比,VA+OVE-DDR1组大鼠海马CA1区神经元LC3阳性表达率及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ均明显降低(P<0.01),p62表达明显升高(P<0.05或P<0.01)(Fig 6)。

Fig 3 Comparison of learning and memory abilities of rats in each group

Fig 4 Neuronal damage in CA1 region of hippocampus of rats in each group

3 讨论

VPA是临床上常用的一线广谱抗癫痫药,在治疗疾病的同时,也会带来一些副作用,研究发现孕妇在孕早期服用VPA可导致后代患ASD的可能性显著增加[10]。以往众多研究已证实,在大鼠孕12.5 d腹腔一次性注射VPA(600 mg·kg-1)能够显著影响子宫内胎鼠脑部发育,导致脑组织发育异常,其与ASD患者临床病因、病理以及行为学症状等具有明显的相似性,被认为是经典的ASD动物造模方法[11]。本研究造模结果显示,与Control组相比,Model组大鼠,学习记忆能力减弱,与临床ASD患者症状极为相似,表明ASD仔鼠模型构建成功,后续实验具有可行性。

Fig 5 Morphology and number of autophagosomes in hippocampal CA1 region of rats in each group

Fig 6 Changes of autophagy marker protein expression in hippocampus of rats in each group

VA是人体生长发育必须的一种微量营养素,在维持神经系统的发育和功能上发挥重要作用。另外,袁小婕等[9]研究证实,VA能够改善VPA诱导的ASD大鼠的行为学表现。本研究观察VA给药后对VPA诱导的ASD大鼠神经行为学的影响。结果显示,与Model组相比,VA组大鼠社交能力增强,重复刻板行为降低,学习记忆能力增强,初步表明VA能够改善Model大鼠ASD症状。海马在空间学习和记忆能力上发挥关键作用,被认为是ASD动物模型中主要的受损脑区域之一。本研究结果显示,与Control组相比,Model组大鼠海马CA1区域神经元明显受损,而给予VA给药处理后ASD大鼠海马CA1区域神经元损伤明显减轻。神经元核抗原(neuronal nuclei,NeuN)仅在成熟的神经元内表达,其NeuN阳性细胞表达数量可以有效反映海马神经元的发育的成熟程度。本研究结果显示,与Control组相比,Model组大鼠海马CA1区域NeuN阳性细胞表达率显著降低,而经VA处理后ASD大鼠海马CA1区域NeuN阳性细胞表达率显著增加,表明VA能够改善ASD大鼠海马CA1区域神经元损伤。但是,目前有关VA对ASD海马神经元的保护机制尚不清楚。

自噬是维持细胞自我平衡的一种自我保护性机制,是细胞内受损细胞器、蛋白聚集以及长周期性蛋白质等生物大分子降解的重要途径,与中枢神经系统发育和神经功能稳态密切相关。既往研究显示,在ASD大鼠海马神经元自噬活性明显降低,增强自噬可以显著改善海马组织兴奋/抑制性突触失衡,从而改善ASD症状,而抑制自噬则会加重ASD相关症状[12]。本研究结果显示,与Control组相比,Model组自噬小体数量明显减少,且自噬标志性蛋白LC3表达显著降低,p62表达显著升高。与Model组相比,VA处理后海马CA1区域自噬小体数量显著增加,且自噬标志性蛋白LC3表达升高,p62表达降低,提示VA可能通过增强自噬水平,改善ASD大鼠海马神经元损伤。DDR1是与细胞增殖、凋亡、炎症等密切相关。另外,Fowler等[13]研究亦发现,抑制DDR1表达能够增加自噬活性,降低神经毒性蛋白表达以及炎症因子释放,从而改善帕金森综合征神经退行性病变。本研究结果显示,与Control组相比,社交能力减弱,重复刻板行为增加,Model组大鼠,海马组织DDR1表达明显增加;VA处理后,ASD大鼠海马组织DDR1表达显著降低,提示VA可能通过抑制DDR1表达,增强自噬活性,从而改善VPA诱导的ASD大鼠海马神经元损伤。本研究通过ASD大鼠侧脑室注射DDR1抑制剂,观察神经行为学变化。结果显示,DDR1抑制剂与VA发挥同向抗ASD作用,大鼠社交能力增强,重复刻板行为降低,学习记忆能力增强,海马CA1区域NeuN阳性细胞表达率增加,自噬小体数量增加,且自噬标志性蛋白LC3表达升高,p62表达降低,神经元损伤减轻,提示DDR1介导自噬可能是VA抗ASD神经元损伤的重要途径。为进一步明确DDR1介导细胞自噬途径在VA抗ASD海马神经元损伤中的作用。本研究对VA组大鼠侧脑室注射DDR1过表达质粒,此时VA对ASD海马神经元的保护作用被逆转,大鼠社交能力减弱,重复刻板行为增加,学习记忆能力减弱,海马CA1区域NeuN阳性细胞表达率显著降低,神经元损伤加重,自噬小体数量显著减少,且自噬标志性蛋白LC3表达降低,p62表达增加,提示VA可以通过下调DDR1表达,激活自噬,从而发挥ASD大鼠海马神经元保护作用。PI3K/Akt/mTOR通路是调控自噬的重要途径,激活PI3K/Akt/mTOR通路能够抑制细胞自噬,调控细胞增殖与凋亡[14]。以往研究显示,DDR1能够通过激活PI3K/Akt信号通路,调控细胞的增殖与凋亡等[15]。

综上所述,本研究通过探究VA对VPA诱导的ASD大鼠神经行为学的影响及作用机制。结果显示,VA能够改善ASD大鼠神经行为,机制与抑制DDR1表达,增强细胞自噬相关。以上研究初步揭示了VA抗ASD的作用机制,为VA用于ASD早期临床治疗提供了理论依据。