近亲婚配致WDR73 纯合突变相关Galloway-Mowat 综合征家系基因检测及生物信息学分析

张 淇，卢 倩，王 一，王秋红，敦 硕，肖少波，邹丽萍，胡琳燕

1 解放军医学院，北京 100853；2 解放军总医院第一医学中心儿内科，北京 100853；3 南开大学医学院，天津 300071；4 解放军总医院第一医学中心神经内科，北京 100853；5 北京脑重大疾病研究院癫痫研究所，北京 100069

1968 年Galloway 和Mowat[1]首次报道了Galloway-Mowat 综合征(Galloway-Mowat syndrome，GAMOS；OMIM 251300)，至今共报道140 余例[2]。该病常见临床表现为婴儿期起病的小头畸形、小脑萎缩、癫痫、共济失调、迟发性精神运动发育、蛋白尿及随年龄增长逐渐出现的肾病综合征[2-3]。GAMOS 的已知致病基因包括WDR73、OSGEP、TP53RK、NUP107、NUP133[4-8]等。WDR73 基因定位于常染色体15q25.2，编码一种含有40～ 60 个氨基酸残基的WD40 重复序列蛋白质[2]。WDR73在正常人体组织中普遍表达，在肾小球和大脑中表达丰富，尤其是浦肯野细胞及其小脑轴突、颗粒细胞神经元、小脑深部核、大脑皮质、海马锥体神经元和大脑毛细血管内皮细胞[4,9-10]。本文分析1 例近亲婚配家庭GAMOS，患儿出生后3 个月被发现视力障碍伴精神运动发育落后，对其及家系行基因检测，探讨其遗传学特征。

对象与方法

1 家系资料收集 收集2021 年10 月就诊于解放军总医院第一医学中心儿科的GAMOS 患儿及其家系资料，主要对象包括患儿及其直系5 代以内血亲。详细收集临床症状、体格检查资料、既往史、个人史、家族史以及基因检测、脑电图、影像学、实验室相关检查结果等。本研究获得患儿监护人知情同意，并经过解放军总医院伦理委员会审查批准(编号：2023-13)。

2 全外显子测序及Sanger 测序 在获得患儿法定监护人及其他受试者的知情同意并签署书面知情同意书后，采集患儿、父母及家系中其他可能携带变异基因者的外周血各3 mL，共14 例(FⅠ-1，FⅠ-2，FⅡ-1，FⅡ-2，FⅡ-5，FⅡ-7，FⅢ-4，FⅢ-5，FⅢ-6，FⅢ-7，FⅣ-1，FⅣ-2，FⅤ-1，FⅤ-2)，家族成员关系见图1。采用家系三人全外显子基因检测技术进行基因组DNA 提取，针对本检测项目包含的相关基因编码区使用目标区域捕获方法进行扩增，并用高通量测序平台进行测序。对在高通量测序中检测到的可疑突变位点，采用Sanger 测序技术对父母及家系中其他成员进行验证。患儿曾外祖父母、外祖父母(FⅡ-3，FⅡ-4，FⅢ-8，FⅢ-9)因拒绝抽血检查未能留存血液样本。

图1 Galloway-Mowat 综合征患者家系系谱图先证者； 携带者；FⅤ-2 先证者；FⅡ-1、FⅢ-4、FⅢ-6、FⅢ-7、FⅣ-2 均为杂合变异；其余未发现变异Fig.1 Pedigree of a patient with Galloway-Mowat syndrome proband; carriers;FⅤ-2 proband；FⅡ-1,FⅢ-4,FⅢ-6,FⅢ-7 and FⅣ-2 were heterozygous,and the others were not found

3 基因数据分析及筛选采用HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee)数据库中记录的基因名称，变异命名规则遵循2016 年更新的HGVS对序列变异描述的建议[11]。变异分析及解读结合致病变异数据库(ClinVar、HGMD、DECIPHER、ISCA、NCBI 等) 以及正常人群数据库(gnomAD、ExAC Browser、OMIM 等)。

4 生物信息学分析利用蛋白功能预测软件Polyphen-2、VEP、SIFT、REVEL、Mutation Taster 等对新发变异进行功能预测；Uniprot 软件分析变异位点是否具有跨种属保守性；Pubmed BLAST 系统分析变异影响的蛋白结构域。根据ACMG 变异分类指南及补充指南，对检测范围内基因变异进行筛查分级，结合送检者的临床表现和相应检查结果，分析与临床表现相关或可能相关的基因变异。

结果

1 患儿资料 患儿男，11 月龄，柯尔克孜族。于3 月龄发现追视差，不抓物，间断出现水平眼震，伴精神运动发育落后，竖头欠稳，就诊于当地医院，查头颅CT 及MRI 均提示双侧侧脑室前角变钝、胼胝体薄、髓鞘化延迟；给予康复训练，患儿运动发育缓慢进步，7 月龄时可竖头，可翻身，但不会独坐；9 月龄当地医院就诊查体头围约45 cm，追声、追物不佳，四肢肌张力稍高，肌力Ⅲ级。4 月龄、9 月龄头颅MRI 均提示胼胝体薄，双侧侧脑室前角钝，髓鞘化延迟(图2)。9 月龄DDST 量表提示适应性、大运动、精细动作、个人-社交重度发育迟缓，语言中度发育迟缓。血尿代谢筛查未发现异常。11 月龄时于解放军总医院第一医学中心儿科查FVEP 示双眼分别在闪光刺激下P2 潜伏期重度延迟，双眼振幅大致正常；ERG(DTL 电极) 示双眼视神经传导功能重度阻滞，双眼视锥细胞、视杆细胞功能重度降低。查肾超声、肾功能、尿常规、尿NAG 酶、β 微球蛋白均未发现异常。

图2 患儿9 月龄头颅MRIA、B 可见胼胝体薄(白色箭头)，B 可见双侧侧脑室前角变钝(黑色星号)；C 可见髓鞘化延迟Fig.2 Head MRI images of the 9-month-old childA and B show thinning of the corpus callosum (white arrows),and B shows bilateral obtuse anterior horn of the lateral ventricles(black asterisks).Panel C shows delayed myelination

2 家族史 患儿系第三胎第二产，39+1周因“瘢痕子宫”剖宫娩出，出生体质量3.55 kg。父母为近亲婚配，父亲为母亲表舅，既往体健。患儿姐姐为足月女孩，因“宫内窘迫”剖宫娩出，现6 岁，体健。在患儿家族成员中，FⅢ-3自幼精神、智力异常，癫痫发作，生活不能自理，28 岁车祸外伤后去世；FⅣ-1生后眼睑下垂，智力运动发育落后，踮脚走路；FⅡ-5双眼发育异常，双眼睑下垂伴水平眼震，视力损害严重；FⅡ-7双眼球上翻伴水平眼震，残存视力可走路。家系图谱见图1。

3 基因检测 基因检测结果显示患儿WDR73 基因纯合移码突变c.972_973dup(p.F325Sfs*10)，查阅相关正常人群分布频率数据库均未收录该变异。经Sanger 测序验证，该纯合变异仅存在于患儿中，在提供血液样本的家族成员中，患儿父母、爷爷、两位姑姑(FⅡ-1，FⅢ-4，FⅢ-6，FⅢ-7，FⅣ-2)均为杂合变异，其余未发现变异(图3)。

图3 先证者及父母全外显子基因测序及家族成员Sanger 测序验证图先证者为c.972_973dup (p.F325Sfs＊10) 纯合移码突变，父母、患儿爷爷及两位姑姑(FⅢ-7、FⅣ-2、FⅡ-1、FⅢ-4、FⅢ-6)为该突变基因位点携带者，其余未见变异(箭头示突变位点位置)Fig.3 Full-exon gene sequencing of proband and parents and sanger sequencing verification of other heterozygous family membersThe proband is homozygous for a frameshift mutation c.972_973dup (p.F325Sfs＊10).His parents,grandfather and two aunts (FⅢ-7,FⅣ-2,FⅡ-1,FⅢ-4,FⅢ-6) were carriers of the mutation locus,no one else has mutated (arrows indicate mutation site locations)

4 生物信息学分析 应用不同的变异预测软件对该变异进行有害性变异预测，提示该变异位于最后一个外显子，在非重复区框内插入导致了蛋白质长度变化；经Uniprot 系统对人类、鼠、斑马鱼、非洲爪蛙及黑猩猩的WDR73 蛋白保守性分析发现该蛋白第325 位氨基酸在无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物乃至哺乳动物之间均高度保守(图4)，提示该位置的氨基酸所致移码突变可能对该蛋白功能有一定影响。根据ACMG 分级，提示致病性变异(PM2+PP3+PVS1)。

图4 经Uniprot (https://www.uniprot.org)分析本例WDR73 突变位点对应编码蛋白在无脊椎动物、脊椎动物、爬行动物乃至哺乳动物之间均高保守Fig.4 Uniprot (https://www.uniprot.org) analysis showed that the WDR73 mutation site in this case was highly conserved among invertebrates,vertebrates,reptiles and even mammals

讨论

本研究通过对1 例GAMOS 患儿进行基因检测，发现患儿WDR73 基因纯合移码突变c.972_973dup(p.F325Sfs*10)。GAMOS 在临床和遗传上存在异质性[3,12-13]，以“Galloway-Mowat”“WDR73”为关键词，在PubMed、中国知网、万方等数据库检索1973 年以来WDR73 基因相关GAMOS 的患儿临床资料，重点总结临床表型及基因变异位点。共发现报道WDR73 基因相关GAMOS 具体突变位点文献9 篇[2-4,9-10,12-15]，共51 例患儿，结合本文病例，共52 例。在有详细数据的文献中，患儿均于2 岁内起病，父母为近亲结婚比例高。临床表现均有精神运动发育迟缓(100%)，此外小头畸形(94.2%)、眼部异常(84.6%)、肾异常(73%)发生率高，其他症状还可见癫痫(69.2%)、面部畸形(23.1%) 等。对于基因变异类型，错义突变19例(36.5%)，移码突变30 例(57.7%)，无义突变3 例(5.8%)，但WDR73 突变类型及位点与GAMOS 的临床表现无明显关系。

在GAMOS 患者中出现的眼部异常，最常见视神经萎缩、眼球震颤和斜视，还包括追视差、上睑下垂等[3,13]。2018 年Al-Rakan 等[3]首次报道了由WDR73 基因缺陷导致的GAMOS 患者视网膜功能异常，并推测WDR73 突变可能通过影响纺锤体功能导致有丝分裂中断，从而导致眼部病变和大脑异常。Racine 和Golden[2]也发现WDR73 双等位基因突变导致了GAMOS 患者的视网膜功能显著缺陷，影响了锥状和杆状光感受器通路。本例患儿肾超声、肾功能、尿常规、尿NAG 酶及β 微球蛋白均未见异常。家长未同意行肾活检，故未能进一步评估肾情况。有文献报道，由WDR73突变引起的GAMOS 患者会表现出迟发且缓慢进展的肾病综合征[12-14]。本研究提示即使在就诊时没有肾受累的情况下也不能排除GAMOS 的可能。本例患儿以眼部异常和精神运动发育迟缓起病，但未出现小头畸形、肾异常等典型症状，提示临床医师当患儿出现类似症状时，应及时进行基因检测以早期识别。

目前，已有10 余种已知基因突变与GAMOS的诊断有关。WDR73 是首个被报道导致GAMOS的基因，且已被证明为GAMOS 的致病突变[4,12-14]。WDR73 也是首个涉及GAMOS 发病机制的基因，有研究表明干扰细胞周期控制可能有助于明确WDR73 相关GAMOS 患者发病机制[10,14]。WDR73在细胞存活、增殖、肾足细胞和神经元细胞的细胞结构和正常功能的维护以及神经系统的发育和成熟中发挥关键作用[9]。WDR73 编码含有WD40重复序列的蛋白质，WD40 重复序列由40～ 60 个氨基酸残基组成，每个WD40 重复折叠成四股反平行β 叶片。已经证明几个编码WD40 结构域蛋白的基因与人类遗传障碍有关，WDR73 突变会导致WD40 重复序列的缺失，可能会阻止这种β 螺旋桨结构的组装，从而影响其功能[4]。有研究表明，WDR73 功能丧失会干扰一系列细胞通路，导致编码细胞周期调节蛋白的基因表达改变[16]。在斑马鱼模型中发现，WDR73 在神经祖细胞增殖和分化中发挥重要作用，当出现缺陷时，会导致发育迟缓和发育不全。该研究同时证明了野生型人类WDR73 基因能够有效地挽救斑马鱼体内脑功能表型的丧失，特别是中脑、小脑的生长和小脑浦肯野神经元的分化，支持了WDR73 脊椎动物同源基因在大脑发育中功能保守的假设[14]。本例患儿WDR73 基因变异位于最后一个外显子，在非重复区框内插入导致了蛋白质长度变化，该位点此前未见报道，本研究扩大了GAMOS 基因谱。

由于患儿家族成员中有眼部异常及精神运动发育落后等症状者(FⅢ-3，FⅣ-1，FⅡ-5，FⅡ-7)，与患儿症状相似，本研究采集了相关成员外周血样本进行基因一代测序验证，但并未发现家族成员症状与该基因突变位点相关性。然而与非近亲婚配相比，近亲婚配会增加群体中隐性遗传病的发病率，而且常染色体隐性遗传病的群体发病率越低，近亲婚配的危险越大[17]。舅甥女亲缘系数为1/4，子女出现先天性出生缺陷的概率为6.4%～9.6%[18]，隐性遗传病发病率为0.0625，比非近亲婚配发病率高出近40 倍[17]。我国1981 年颁布的《中华人民共和国婚姻法》明确规定，直系血亲和3 代内旁系血亲禁止婚配[17-18]。对于少数民族婚姻风俗与婚姻法相冲突的问题，我们从医学遗传学角度出发，提倡适度改变风俗，普及相关法律法规及医学知识，以更全面地实现优生优育。

综上，本研究中检测到的WDR73 基因纯合移码突变为患儿的致病病因，不仅明确了诊断，且c.972_973dup(p.F325Sfs*10) 是未报道过的新变异，扩大了WDR73 突变导致GAMOS 基因变异谱。同时提示临床工作者，对于眼部异常及发育迟缓尤其是父母为近亲婚配婴幼儿，要警惕GAMOS 的可能，应早期进行基因检测。对于少数民族近亲婚配习俗，建议优生优育，减少隐性遗传病的发生。

作者贡献张淇：研究设计，资料收集，论文撰写；卢倩：论文撰写与修改；王一、王秋红、敦硕、肖少波：资料收集；邹丽萍、胡琳燕：研究设计，论文撰写与修改。

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