淫羊藿苷-淀粉纳米纤维的制备及其药物释放性能

郭文娟，邱 帅，李 楠，代 昭

（1.天津工业大学化学工程与技术学院，天津 300387；2.天津工业大学化学学院，天津 300387）

淫羊藿，又名仙灵脾，性味辛甘温，有强筋健骨、补肾壮阳的药效，始载于《神农本草经》，是一种拥有2 000 多年药用历史的传统中草药。淫羊藿苷（icariin，ICA）是提取自小檗科淫羊藿属植物的一种黄酮苷类化合物，是淫羊藿的主要活性成分。现代药理学研究表明，淫羊藿苷在神经、骨骼、心血管系统等方面能发挥良好的保护作用，还拥有较好的免疫调节、抗炎、抗衰老、抗肿瘤等药理活性[1-2]。由于淫羊藿苷拥有良好的促软骨生成[3]、修复骨缺损[4]、防治骨质疏松[5]、减轻骨关节炎等[6]功能，因此，经常被作为药物用于组织工程领域。孙一丹[7]以β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate，β-TCP）和聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）为基材，通过3D 打印制备了负载淫羊藿苷的复合支架，尝试用于颅颌面部骨缺损，结果表明淫羊藿苷的加入提高了成骨效果。郭晓鹏等[8]采用物理共混法制备负载淫羊藿苷的丝素蛋白/纳米羟基磷灰石水凝胶，经动物实验后结果表明，负载有淫羊藿苷的丝素蛋白/羟基磷灰石水凝胶，可促进移植骨髓间充质干细胞增殖并分化为髓核样细胞，增加细胞基质的合成，促进退变椎间盘的修复。

使用静电纺丝法制备的纳米纤维拥有三维空间交叉网络，具有药物的控释接触面积较大、网络孔隙较易调控、制备简单等特点，成为骨组织工程领域应用的新型热点材料[9-10]。淫羊藿苷是优异的骨科药材，纳米纤维是优良的骨组织工程载体，但目前将二者结合起来的研究并不多。董志恒等[11]以淫羊藿苷为药物，以聚己内酯为基材，通过静电纺丝法制备了淫羊藿苷-聚己内酯纳米纤维（直径300～600 nm），结果表明，纳米纤维之间形成了三维的网状空间结构，且拥有良好的药物缓释性能和促成骨性能。

淀粉是最容易获得的天然来源多糖材料之一，其加工过程简单，成本低廉，生物亲和性高、相容性好，经常与PVA、羟基磷灰石、β-磷酸三钙等一起作为组织工程材料[12-13]。本研究采用淫羊藿苷为药物，以可溶性淀粉为独立基材，通过静电纺丝法制备淫羊藿苷-淀粉纳米纤维，对纳米纤维的形成与淫羊藿苷的体外释放进行研究，以期利用淀粉的高生物相容性与易获得性，为淀粉与淫羊藿苷在骨组织工程的进一步应用奠定基础。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

主要试剂：淫羊藿苷（纯度96%）、可溶性淀粉（分析纯），均为上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；甲酸、25%戊二醛（分析纯），均为天津市科密欧化学试剂有限公司产品；磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）、芦丁标准品、甘氨酸，百灵威科技有限公司产品。

主要仪器：UV2600 型紫外分光光度计，日本岛津公司产品；Gemini SEM500 型场发射扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司股份有限公司产品；静电纺丝仪，自制。

1.2 淫羊藿苷-淀粉纤维的制备

（1）淀粉纳米纤维制备：甲酸不仅可以溶解淀粉，还对淀粉有酯化作用，破坏淀粉分子间的氢键和分子链刚性，促使淀粉充分溶解和结晶区的破坏，并引发淀粉分子在溶剂中进行分子链间的重排和纠缠，这对静电纺丝是非常有利的，因此，可用于制备纳米级淀粉纤维[14-15]。研究表明，使用静电纺丝法制备淀粉纳米纤维时，纯溶剂的纺丝效果优于水混合溶剂[16-17]。准确量取一定量甲酸溶剂加入磨口锥形瓶中，加热至30 ℃，按照质量配比精确称量可溶性淀粉粉末，在磁力搅拌下仔细加入到溶剂中，10 min 内加入完成。用磨口瓶塞将锥形瓶密封，在集热式恒温加热磁力搅拌器中提升温度至70 ℃，持续搅拌24 h 后，溶液完全溶解，得到无色透明的淀粉纺丝溶液。用注射器吸取5 mL 纺丝液，与静电纺丝机一起放置于可控温度与湿度的箱中，控制箱内环境为温度40 ℃、相对湿度15%。稳定1 h 后，设置辊筒接收器转速150 r/min，移动距离为170 mm，移动速率为900 mm/min。在不同纺丝液浓度、不同溶剂配比下进行静电纺丝5 h，纺丝完成后从辊筒上取下所得纳米纤维，于40 ℃真空烘箱中干燥24 h，获得淀粉纳米纤维。

（2）淫羊藿苷-淀粉纳米纤维制备：按照不同淀粉/淫羊藿苷比例配置纺丝液，在最佳纺丝条件下制备载药纳米纤维。将上述所制备的纤维与盛有100 mL 25%戊二醛水溶液的烧杯同时放置于2 L 的密闭容器中，在常温下戊二醛蒸汽挥发交联24 h，然后用0.1 mol/L 的甘氨酸水溶液、PBS 磷酸缓冲液反复冲洗3次，得到淫羊藿苷-淀粉纳米纤维。

1.3 性能测试与表征

（1）形貌表征：采用Gemini SEM500 型场发射扫描电子显微镜观察纳米纤维的外观形貌。

（2）体外释放量测试：准确称取芦丁标准品5.0 mg，配置质量浓度为0.01～0.50 mg/mL 标准液，使用UV2600 型紫外分光光度计在507 nm 处测量吸光度，得到标准工作曲线为：

式中：A为吸光度；C为质量浓度。精确称取一定量的淫羊藿苷-淀粉纳米纤维，将其放入盛有50 mL PBS缓冲液（pH=7.4）的100 mL 锥形瓶中，塞上磨口瓶塞并以封口膜密封，于37 ℃在恒温气浴摇床中以80 r/min 的速率振荡。经过不同振荡时间后取3 mL 上层溶液在507 nm 处进行定波长测量，根据标准工作曲线计算释放量。

2 结果与讨论

2.1 淀粉质量分数的影响

当纺丝电压为20 kV、纺丝液推注速率为0.5 mL/h、接收距离为10 cm 时，改变纺丝液中淀粉的质量分数，所得淀粉纳米纤维形貌如图1 所示。

图1 淀粉质量分数对淀粉纳米纤维外观形貌的影响Fig.1 Effect of mass fraction of starch on morphology of starch nanofibers

当淀粉浓度较低时，游离的溶剂较多，若溶剂在纤维成型过程中未能充分挥发，则可能对接收器上的纤维进行二次溶解和聚并，从而形成结块或串珠；当淀粉浓度较高时，游离的溶剂较少，溶剂挥发难度增加，这将对泰勒锥的形成和劈裂成丝增加阻碍，因此，未能充分劈裂的液滴将直接喷射在接收器上，也将导致结块或串珠[17]。由图1 可以看出，淀粉质量分数为19%时成纤率较高，因此，后续采用19%作为淀粉基准质量分数，对其他条件进行优化以获得更好的纺丝条件。

2.2 纺丝液推注速率的影响

当淀粉质量分数为19%、电压为20 kV、接收距离为10 cm 时，不同纺丝液推注速率条件下所得淀粉纳米纤维形貌如图2 所示。

图2 纺丝液推注速率对淀粉纳米纤维外观形貌的影响Fig.2 Effect of feed rate of spinning solution on morphology of starch nanofibers

由图2 可以看出，随着推注速率的增加，所得纤维增多；当推注速率为0.5 mL/h 时，所得纤维形状较好，分布比较均匀；但当推注速率增加到0.7 mL/h 时，淀粉的结块增加，表明此时溶剂的挥发还不完全。如要制备形态较好、直径分布较窄的纳米纤维，一个重要的因素是纺丝液的流延性和推注速率较为协调。较低的纺丝液推注速率将导致较多的溶剂挥发，纺丝液被拉伸的难度增加，导致生成纤维较少，纤维较细；但是若推注速率过快，溶剂挥发会显著减慢，将导致纤维携带大量溶剂被直接喷射于接收器上，导致结块或串珠[18]。

2.3 接收距离的影响

当淀粉质量分数为19%、电压为20 kV、推注速率为0.5 mL/h 时，考察接收距离对淀粉纳米纤维外观形貌的影响，结果如图3 所示。

图3 接收距离对淀粉纳米纤维外观形貌的影响Fig.3 Effect of spinning distance on morphology of starch nanofibers

由图3 可以看出，当针头与接收器距离为16 cm时，所得纳米纤维形态较好，所形成的串珠最少。由此可见，纺丝针头与接收器的距离也是影响溶剂挥发的另一个重要因素[16]。当距离较短时，纺丝液溶剂未能完成有效挥发就被喷射至接收器表面形成结块；当距离过远时，溶剂挥发较快，纤维之间会互相聚集成块被喷射到接收器上[16，18]。

2.4 电压的影响

一般情况下，增大纺丝电压，将减小纳米纤维的直径[19-20]。当淀粉质量分数为19 %、推注速率为0.5 mL/h、接收距离为16 cm 时，考察不同电压对淀粉纳米纤维外观形貌的影响，结果如图4 所示。

图4 电压对淀粉纳米纤维外观形貌的影响Fig.4 Effect of voltage on morphology of starch nanofibers

由图4 可以看出，电压为17 kV 时，所得纤维直径范围为0.12～0.79 μm，平均直径为0.41 μm，36.7%的纤维直径处于[0.3，0.4）μm，整体分布较宽；当电压为18 kV 时，纤维直径0.11～0.83 μm，平均直径为0.34 μm，直径处于[0.2，0.3）μm 和[0.3，0.4）μm 的纤维均约为33.3%，整体分散度变宽，随着电压增高，纤维的平均直径变小；电压为19 kV 时，所得纤维直径范围为0.17～0.60 μm，平均直径为0.30 μm，纤维的平均直径随着纺丝电压的增高继续降低，直径处于[0.2，0.3）μm的纤维约为46.9%，处于[0.3，0.4）μm 的纤维约为40.6%，整体呈现窄分布。

2.5 淫羊藿苷投入量的影响

以淫羊藿苷为药物，在淀粉质量分数为19%、电压为19 kV、推注速率为0.5 mL/h、接收距离为16 cm条件下，制备不同淫羊藿苷投入量的淀粉纳米纤维，所得淫羊藿苷-淀粉纳米纤维的SEM 照片与相应直径分布如图5 所示。

图5 淫羊藿苷/淀粉质量比对纳米纤维外观形貌的影响Fig.5 Effects of mass ratio of icariin/starch on morphology of nanofibers

由图5 可以看出，当淫羊藿苷/淀粉的质量比较低（4%）时，所得纤维直径范围为0.13～0.62 μm，平均直径为0.27 μm，有58.06%的纤维直径处于[0.2，0.3）μm，与未添加淫羊藿苷（图4（c））相比，其纤维直径范围基本保持不变，但平均直径有略微的减小，这表明少量淫羊藿苷的小分子加入对淀粉的成纤影响较少。当淫羊藿苷/淀粉的投入质量比增加到6%时，所得纤维直径范围为0.13～0.52 μm，平均直径为0.28 μm，41.94%的纤维直径处于[0.2，0.3）μm，处于此区间的纤维数量继续减少，而直径处于[0.1，0.2）μm 的纤维总量增加到25.81%。由此说明，淫羊藿苷用量增大，导致总体纤维的平均直径继续减小，这表明淫羊藿苷与溶剂之间的相互作用开始影响淀粉的分散状态。当淫羊藿苷/淀粉的投入质量比增加到8%时，所得纤维直径范围为0.15～0.65 μm，平均粒径为0.32 μm，有48.39%的纤维直径处于[0.2，0.3）μm，但是从直径分布图上来看，纤维的直径分布开始变宽，粗纤维有所增加，SEM 照片中显示串珠出现，代表淫羊藿苷投入量的继续增加对淀粉的良好分散产生了不良影响[21]。因此，从载药量与纤维形态进行综合考虑，淫羊藿苷质量为淀粉质量的6%时为最佳。

2.6 戊二醛交联的影响

使用25%的戊二醛蒸汽交联法对所得6%淫羊藿苷-淀粉纳米纤维进行交联，所得纤维的扫描电镜照片与相应纤维的直径分布如图6 所示。

图6 交联淫羊藿苷-淀粉纳米纤维SEM 照片及其直径分布图Fig.6 SEM photo and diameter distribution of crosslinked icariin-starch nanofibers

由图6 可以看出，交联后的纤维出现了收缩结节现象，交联后的纤维直径范围为0.10～0.69 μm，平均直径为0.31 μm。

2.7 淫羊藿苷-淀粉纳米纤维的体外释药性能

在37 ℃下，在磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）中对交联前后淫羊藿苷-淀粉纳米纤维的体外释放进行研究，结果如图7 所示。

图7 淫羊藿苷-淀粉纳米纤维交联前后的体外释放曲线Fig.7 In vitro release profiles of icariin-starch nanofibers before and after crosslinking

由图7 可以看出，淫羊藿苷从纤维中的释放都存在突释、缓释和平衡3 个释放阶段。未交联纤维的突释期大约为2 h，淫羊藿苷的释放量为45.5%；随后进入了缓释期，24 h 时的释放量达到78.2%；随后进入平衡期，168 h 时释放量为96.12%。纤维交联后，淫羊藿苷的释放出现了明显的缓释性能，其突释期也大约是2 h，释放量为31.6%；随后进入了较为平缓的缓释期，大约一直维持到120 h，释放量为62.6%；在平衡阶段，168 h 时达到64.9%。这表明交联可显著降低淀粉的崩解速度，纤维主要发生溶胀，因此，有利于降低淫羊藿苷的释放速率。

3 结 论

以甲酸为溶剂，以可溶性淀粉为基材，通过使用静电纺丝法制备了负载淫羊藿苷的淀粉纳米纤维，对淀粉纳米纤维的制备规律进行了研究，结果表明：

（1）当淀粉质量分数为19%、电压为19 kV、推注速率为0.5 mL/h、接收距离为16 cm 时能够获得纤维直径分布较窄、形态较好的淀粉纳米纤维，此时纤维直径范围为0.17～0.60 μm，平均直径为0.30 μm，直径处于[0.2，0.4）μm 的纤维约占87.5%，整体呈现窄分布。

（2）当淫羊藿苷质量为淀粉质量的6%时，能够获得形态较好的载药纤维，纤维直径范围为0.13～0.52 μm，平均直径为0.28 μm，41.94%的纤维直径处于[0.2，0.3）μm。

（3）体外释放研究结果表明，交联可大幅增加载药纤维的药物缓释性能，168 h 时只释放了64.9%的淫羊藿苷。