不同基原淫羊藿补肾壮阳相关药效学比较研究

★ 胡浩武 高羽,2 周青罡 解立科 陈明苍（.江西汇仁药业股份有限公司 南昌 0052；2.中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所 北京 009；.中国科学院上海药物研究所 上海 2020）

淫羊藿为常用的补肾壮阳药物，具有温补肾阳、强筋健骨、祛风除湿、止咳平喘等作用，常用于肾阳虚弱、阳痿尿频、筋骨痿软、腰膝无力、风湿痹痛、肢体麻木等症的治疗［1］。2020年版《中国药典》收载了4种基原植物，即心叶淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimedium sagittatum（Sieb. et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescensMaxim.和朝鲜淫羊藿Epimedium koreanumNakai。研究发现，不同基原的淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、宝藿苷Ⅰ等含量存在较大差异［2-3］，有效成分含量的差异可能会引起药效学差异，然而不同基原淫羊藿的药效作用有无明显优劣未见文献报道。本实验针对淫羊藿补肾壮阳的传统功效，选择氢化可的松制备肾阳虚证动物模型，比较不同基原淫羊藿在补肾壮阳方面的药效学差异，为其临床药材的选用提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Chemray 240全自动生化分析仪（深圳雷杜生命科技公司）；ADVIA Centaur XP全自动化学发光免疫分析仪（西门子有限公司）；i200全自动免疫分析仪（美国雅培有限公司）；EPOCH全波长酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；小动物PET/CT活体成像系统（PerkinElmer）；COBAS C501全自动生化分析仪（罗氏公司）。

1.2 药材与样品制备

心叶淫羊藿，采自甘肃陇南；朝鲜淫羊藿，采自吉林集安；箭叶淫羊藿，采自四川达州市大竹县。经江西汇仁药业股份有限公司张聪中药师鉴定均为正品。不同基原淫羊藿醇提物样品均由实验室自制。

1.3 材料

丙二醛MDA测试盒（批号：20190118）、总超氧化物歧化酶SOD测试盒（批号：20190327）均购自南京建成生物工程研究所；三碘甲状原氨酸（T3）试剂盒（批号：01569208）、甲状腺素（T4）试剂盒（批号：27832196）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）试剂盒（批号：18932234）、游离甲状腺素（T4）试剂盒（批号：01486107）均购自西门子公司；睾酮试剂盒（批号：10766UP00）购自雅培公司；肌酐试剂盒（批号：181212018）购自德国罗氏诊断有限公司；环磷酸腺苷（cAMP）试剂盒（批号：L190401109）和环磷酸鸟苷（cGMP）试剂盒（批号：L190312247）均购自武汉云克隆科技股份有限公司；氢化可的松注射液（批号：1801170231/1801180231）购自上海现代哈森药业有限公司。

1.4 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，体重180~220 g，150只，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证编号为SCXK（沪）2017-0005。动物饲养于标准环境，温度22~26 ℃，相对湿度40%~70%，人工光照，12 h明暗周期，标准颗粒饲料喂养，动物自由饮水采食。大鼠适应饲养环境1周后进行实验。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药

SD大鼠按体重随机分为11组，每组9只，分为正常组，模型组，心叶淫羊藿高、中、低剂量组（生药量 10，5，1 g/kg），朝鲜淫羊藿高、中、低剂量组（生药量10，5，1 g/kg），箭叶淫羊藿高、中、低剂量组（生药量10，5，1 g/kg）。除正常组皮下注射等容量生理盐水外，其余各组大鼠按25 mg/kg剂量皮下注射氢化可的松，连续20 d，复制肾阳虚证模型。并于造模同时进行给药干预。所有药物均采用0.5%CMC-Na溶液研磨配置。淫羊藿各剂量组灌胃给药，正常组、模型组灌胃同体积饮用水，连续给药20 d。

2.2 骨密度、破骨细胞数量和成骨细胞比例测定

采用小动物PET-CT进行离体股骨骨密度测定，根据标准曲线换算骨密度。股骨经多聚甲醛固定，脱钙后切片，TRAP染色，并统计破骨细胞数量（个/200倍视野）。股骨经脱钙后切片，进行成骨细胞标志物骨钙素OCN免疫组化染色，并统计扫描片上成骨细胞比例。每组内每张切片随机挑选至少3个200倍视野进行截图。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取相同的棕黄色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出，每张照片阳性的累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA），并求出平均光密度值（AO），AO（%）=IOD/AREA×100。

2.3 血清生化指标测定

末次给药后腹主动脉取血测定血清中MDA、T3、T4、FT3、FT4、睾酮、肌酐、cAMP和cGMP。

2.4 肾脏HE病理

肾脏经过多聚甲醛固定后，切片，HE染色，之后计算机扫描获得病理照片。

2.5 统计学方法

通过SPSS 22.0统计软件进行处理。数据用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 对肾阳虚大鼠体重和摄食量的影响

与正常组比较，肾阳虚模型大鼠的体重和每日摄食量出现显著下降；与模型组比较，各给药组大鼠体重和摄食量无明显变化。

3.2 对血清甲状腺功能指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠的甲状腺功能指标（T3、T4、FT3、FT4）均显著下降（P＜0.01）；与模型组相比较，心叶淫羊藿各剂量组均能不同程度提高T3、T4、FT3和FT4水平，中、低剂量组对大部分指标表现出显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）；朝鲜淫羊藿中、低剂量组与模型组比各指标均有显著性差异；箭叶淫羊藿低剂量组大鼠的T4和FT4明显升高，差异均有统计学意义，但高、中剂量组对各指标均无显著差异。见表1。

表1 对血清甲状腺功能指标的影响（，n=9）

表1 对血清甲状腺功能指标的影响（，n=9）

注：与正常组比较，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 T3/（nmol·L-1） T4/（nmol·L-1） FT3/（pmol·L-1） FT4/（pmol·L-1）正常组 0.8±0.1 52.9±7.3 6.9±0.7 35.7±3.7模型组 0.6±0.1ΔΔ 27.8±5.9ΔΔ 5.0±1.6ΔΔ 27.9±4.7ΔΔ心叶淫羊藿低剂量组 0.7±0.1* 33.0±4.7* 5.9±0.6 32.8±2.2**心叶淫羊藿中剂量组 0.7±0.1 35.2±7.7* 6.0±0.8 32.5±3.8*心叶淫羊藿高剂量组 0.7±0.2 32.6±9.8 6.4±0.7* 31.2±4.5朝鲜淫羊藿低剂量组 0.8±0.2* 39.1±11.3* 6.3±0.5* 34.0±3.7**朝鲜淫羊藿中剂量组 0.8±0.2* 34.3±6.2* 6.3±0.4* 32.1±3.5*朝鲜淫羊藿高剂量组 0.7±0.1 34.5±11.3 4.2±0.5 31.6±3.8箭叶淫羊藿低剂量组 0.7±0.1 36.2±7.9* 4.2±0.4 34.6±3.3**箭叶淫羊藿中剂量组 0.7±0.1 27.0±7.0 4.0±0.3 29.6±4.3箭叶淫羊藿高剂量组 0.7±0.1 26.5±6.0 4.0±0.3 27.1±4.1

3.3 对血清肾功能指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠的肌酐水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，心叶淫羊藿和朝鲜淫羊藿的中、低剂量组可显著降低血肌酐含量，而箭叶淫羊藿各剂量组无明显作用。见表2。

表2 对血清中肌酐、MDA、睾酮的影响（，n=9）

表2 对血清中肌酐、MDA、睾酮的影响（，n=9）

注：与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

睾酮/（nmol·L-1）正常组 21.1±3.8 5.9±0.7 19.1±3.8模型组 25.7±4.8Δ 7.1±0.6ΔΔ 9.8±3.6ΔΔ心叶淫羊藿低剂量组 21.2±2.8* 6.6±0.6 15.7±3.0**心叶淫羊藿中剂量组 21.0±4.0* 5.9±0.9** 15.8±4.5**心叶淫羊藿高剂量组 23.7±3.6 6.1±0.9* 11.8±3.4朝鲜淫羊藿低剂量组 20.1±3.3* 7.4±1.5 16.3±3.8**朝鲜淫羊藿中剂量组 21.4±3.2* 7.1±1.4 19.8±3.8**朝鲜淫羊藿高剂量组 24.4±4.2 6.9±0.6 13.7±4.3*箭叶淫羊藿低剂量组 25.3±2.3 5.6±0.9** 9.7±3.8箭叶淫羊藿中剂量组 23.2±4.6 5.9±1.0** 9.8±4.5箭叶淫羊藿高剂量组 23.4±6.0 6.5±1.1 8.5±2.8组别 肌酐/（μmol·L-1）MDA/（pmol·L-1）

3.4 对血清氧化指标的影响

与正常组比较，模型组大鼠的MDA水平显著升高（P＜0.01）；与模型组比，心叶淫羊藿的高、中剂量组以及箭叶淫羊藿的中、低剂量组大鼠MDA明显下降，差异具显著性（P＜0.05，P＜0.01），而朝鲜淫羊藿各剂量组无显著变化。见表2。

3.5 对血清睾酮的影响

与正常组比较，模型组大鼠的睾酮水平显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，心叶淫羊藿的低、中剂量组以及朝鲜淫羊藿各剂量组大鼠的睾酮水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），而箭叶淫羊藿无明显作用。见表2。

3.6 对股骨骨密度和股骨破骨细胞、成骨细胞的影响

与正常组比较，模型组大鼠的骨密度和成骨细胞比例明显降低，破骨细胞数量明显增加，差异具显著性（P＜0.05）；与模型组相比，心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿各剂量组均可不同程度地增加骨密度，部分剂量达到统计学差异水平（P＜0.05，P＜0.01）；心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿各剂量组均可明显降低破骨细胞数量；3种淫羊藿对成骨细胞比例虽有增加趋势，但未达到统计学差异水平。见表3。

表3 对大鼠股骨骨密度的影响（，n=9）

表3 对大鼠股骨骨密度的影响（，n=9）

注：破骨细胞数量指200倍视野下；与正常组比较，ΔP＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

成骨细胞比例/%正常组 1343.5±24.5 36.8±13.8 0.28±0.13模型组 1315.5±22.9Δ 50.6±10.5Δ 0.15±0.05Δ心叶淫羊藿低剂量组 1334.2±26.1* 43.1±9.0 0.19±0.05心叶淫羊藿中剂量组 1339.8±25.1* 40.3±6.6* 0.18±0.07心叶淫羊藿高剂量组 1344.0±28.1* 39.0±7.2* 0.18±0.06朝鲜淫羊藿低剂量组 1344.7±28.8* 32.2±5.1** 0.18±0.07朝鲜淫羊藿中剂量组 1338.3±18.0* 35.1±6.1** 0.19±0.09朝鲜淫羊藿高剂量组 1338.2±224.4 38.9±5.4* 0.17±0.07箭叶淫羊藿低剂量组 1327.6±12.1* 35.2±5.5** 0.19±0.10箭叶淫羊藿中剂量组 1337.1±16.6* 37.6±8.1* 0.16±0.05箭叶淫羊藿高剂量组 1331.4±8.6 37.9±7.8** 0.17±0.08组别 骨密度/（mg·cc-1）破骨细胞数量/个

3.7 对血清cAMP、cGMP及比值的影响

与正常组比较，模型组大鼠的cAMP和cAMP/cGMP明显降低，cGMP明显增加，差异具显著性（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组相比，心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿各剂量组均可明显增加cAMP，除箭叶淫羊藿中剂量组外各给药组的差异具显著性（P＜0.01）；cGMP指标上，各给药组与模型组比无明显变化；各给药组的cAMP/cGMP比值均有不同程度增加，其中朝鲜淫羊藿中、高剂量组达到统计学差异（P＜0.05）。见表4。

表4 对血清cAMP、cGMP及比值的影响（，n=9）

表4 对血清cAMP、cGMP及比值的影响（，n=9）

注：与正常组比较，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

cAMP/cGMP正常组 98±20 475±139 229±99模型组 55±23ΔΔ 923±518Δ 77±57ΔΔ心叶淫羊藿低剂量组 87±12** 938±370 108±48心叶淫羊藿中剂量组 98±16** 947±401 117±46心叶淫羊藿高剂量组 104±22** 1 208±423 91±18朝鲜淫羊藿低剂量组 167±71** 1 146±239 146±60朝鲜淫羊藿中剂量组 185±54** 1 049±266 208±99*朝鲜淫羊藿高剂量组 181±61** 1 136±384 177±74*箭叶淫羊藿低剂量组 110±31** 1 164±621 120±63箭叶淫羊藿中剂量组 92±57 1 302±705 95±82箭叶淫羊藿高剂量组 116±48** 1 025±720 136±99组别 cAMP/（ng·mL-1）cGMP/（pg·mL-1）

3.8 对肾脏病理的影响

肾脏病理检查表明，肾阳虚模型组可见肾小球球囊间隙明显增宽，提示肾小囊内压增大。与模型组相比，心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿以及箭叶淫羊藿个别剂量组能明显改善肾小球球囊间隙增宽，代表性图像见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织的典型病理形态图（HE染色）

4 讨论

肾阳虚证模型制备目前应用最广泛的是采用氢化可的松诱导大鼠或小鼠肾阳虚模型［4-5］，该模型存在着下丘脑-垂体-靶腺轴（肾上腺轴、甲状腺轴、性腺轴）不同环节、不同程度的功能紊乱，类似于临床肾阳虚证的基本病理特征［6］，通常表现为促肾上腺皮质激素（ACTH）下降，cAMP、cGMP含量及比值改变，睾丸分泌T水平下降，产生大量氧自由基导致脂质过氧化，骨密度和骨代谢指标变化等［5,7-8］。本研究采用大鼠皮下注射氢化可的松模型模拟肾阳虚证［9］，造模前大鼠发育正常、饮食正常、被毛理顺光泽，造模后大鼠的体重显著下降、甲状腺功能指标下降、肌酐和MDA水平显著升高、睾酮水平显著降低、骨密度和成骨细胞比例明显降低、破骨细胞数量明显增加、cAMP明显降低、cGMP明显增加、肾小球球囊间隙明显增宽，符合临床肾阳虚证的基本病理特征，表明模型建立成功。

本研究结果显示，不同基原淫羊藿对肾阳虚不同药效指标的影响有相似性，但在药效强度上也存在着一定差异性：（1）对血清甲状腺功能指标的改善作用：心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿均能不同程度地提高甲状腺激素T3、T4、FT3和FT4的水平，而箭叶淫羊藿对T4和FT4有明显改善作用，总体上朝鲜淫羊藿作用最强，心叶淫羊藿次之，箭叶淫羊藿较弱；（2）对肾功能指标的改善作用：心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿均可显著降低血肌酐水平，两者药效相当，而箭叶淫羊藿作用不明显；心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿均能明显改善肾小球球囊间隙增宽；（3）抗氧化作用：心叶淫羊藿和箭叶淫羊藿均可显著降低MDA水平，两者药效相当，而朝鲜淫羊藿作用不明显；（4）对血清睾酮的影响：心叶淫羊藿和朝鲜淫羊藿可显著增加睾酮水平，而箭叶淫羊藿作用不明显；（5）对骨密度和破骨细胞、成骨细胞的影响：心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿均可显著增加骨密度，降低破骨细胞数量，三者药效作用强度相当；（6）对血清cAMP、cGMP及比值的影响：心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿均可显著提高cAMP，朝鲜淫羊藿可显著提高cAMP/cGMP比值，总体上朝鲜淫羊藿的作用稍强。文献显示这3种基原淫羊藿化学成分总黄酮含量差别不大，而在特征性有效成分淫羊藿苷、朝藿定C和宝藿苷Ⅰ含量上，箭叶淫羊藿与心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿的差异较大，结合本实验结果，提示箭叶淫羊藿在个别药效指标上作用强度的差异性可能和主要特征性有效成分含量差异性有关。

本实验结果显示，各给药组对肾阳虚不同药效学指标的影响没有剂量依赖性，就甲状腺功能指标上来说，朝鲜淫羊藿低剂量组与模型组比较，已具有显著性差异，但是高剂量组没有显著性差异或者高剂量组的指标水平没有升高反而降低，可能原因在于中药成分和作用机理复杂，其药效是多组分的联合作用，而且往往具有双向调节作用，剂量过大可能会引起了负反馈作用［10］。而体内甲状腺激素本身存在着一个反馈调节系统，当甲状腺激素分泌过多时，会抑制促甲状腺激素（TSH）的释放，反过来会减少甲状腺激素的分泌，从而达到甲状腺激素的调节和稳态［11］，这种效应会抵消药物的作用，使药物的疗效下降或丧失。

综上所述，本研究结果提示心叶淫羊藿、朝鲜淫羊藿和箭叶淫羊藿3种基原淫羊藿在治疗肾阳虚证方面可以相互替代，但药效作用强度的侧重点有所差异，临床应用上在必要时可根据肾阳虚证症状表现上的差异或用药需求区别使用。