基于网络药理学探讨黄精防治肺结核的作用及其机制

吴宇培,要 辉,2,张雨晨,2,黄 婷,王琢文,蒋 凯,王洁琼,杨洪飞,葛婷婷,闵 清,2*

(1.湖北科技学院医学部药学院,湖北 咸宁 437100;2.鄂南特色中药湖北省工程研究中心)

肺结核(pulmonary tuberculosis,PTB)是一种由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,M.tb)引起的慢性肺部传染病[1]。该病由肺结核排菌患者通过飞沫传播的方式对易感人群进行传播,肺部组织感染后会出现炎性渗出、增生和干酪样坏死,继而形成空洞,同时伴有咳嗽、呼吸困难、食欲不振、咯血、发热、盗汗等病征[2]。根据世界卫生组织(world health organization,WHO)2022年的统计报告中,每年有超过百万的病例因肺结核而去世,中国的多耐药及利福平耐药肺结核(MDR/RR-TB)病例的比例也达到了3.4%[3]。当前的一线抗结核药有利福平(rifampin,RFP,R)、异烟肼(isoniazid,INH,H)、吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA,Z)、乙胺丁醇(ethambutol,EMB,E),2H-R-Z-E/4H-R(E)方案为基本治疗方案。随着化合药的不断使用以及疾病的发生与发展,耐药性、治疗时间长、不良反应多、疗效不理想等问题随之出现,中西医结合疗法逐渐体现出其优势,因此,研究适合治疗肺结核的中药具有重要意义[4]。

黄精,百合科黄精属植物,其干燥根茎部分入药,入药黄精多为滇黄精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)、多花黄精(P.cyrtonema Hua)等,为《中国药典》2020年版一部收载品种。黄精归肺经,具有补气养阴、健脾、润肺的功效,而肺结核在中医概念称为“肺痨”,起因于肺部。2016年至今,中文数据库中已有23项黄精与不同药物联用治疗肺结核的专利出现,如曹周作等[5]发明了黄精与冰糖合用治疗肺结核的专利;戴龙勇等[6]发明了包含治疗肺结核的新型肺泰胶囊,其中黄精均为君药。本研究利用中药网络药理学及分子对接等方法探讨黄精防治肺结核的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 黄精有效化合物的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP;https://tcmspw.com/index.php),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%以及药物相似性(drug-likeness,DL)≥0.18的标准,对黄精的有效性成分予以筛查。

1.2 黄精有效化合物靶点的筛选

通过TCMSP,本研究进一步筛选了黄精有效成分对应的靶点。为了进一步全面预测靶点,本研究采用Swiss Target Prediction数据库(www.Swisstarget prediction.ch)再次筛选,以补充有效化合物靶标。剔除TCMSP与Swiss Target Prediction数据库的重复部分,利用UniProt数据库(https://www.unipro.org)进行标准名称规范化处理。

1.3 肺结核相关靶点的预测

通过利用“pulmonary tuberculosis”“TB”作为搜索词,本研究分别在DrugBank(https://go.Drugbank.com/)、OMIM(https://omim.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、pharmgkb(https://www.pharmgkb.org/)4个不同的数据库获取相关靶标,并对其进行详细筛查,删除重复靶点,确定肺结核疾病相关靶点。

1.4 黄精与肺结核疾病共同靶点的筛选

本研究通过筛选出的黄精有效化合物靶点和肺结核疾病相关靶点编辑为txt格式的文档,然后使用R语言来构建黄精与肺结核靶点的交集图,形成Venn图,以便更好地了解这些特征之间的联系。

1.5 构建黄精-活性成分-靶点-肺结核网络图

首先将1.2、1.3、1.4中筛选得到的药物有效化合物、药物作用于疾病的相关靶点、疾病相关靶点、药物与疾病相交集的靶点分别进行整理,汇总于一个文档,注明相关属性及分类,并将所整理的文件用.txt格式导入Cytoscape 3.7.2中,利用Cytoscape 3.7.2的可视化功能构建药-活性成分-靶点-疾病网络互作图。

1.6 蛋白质相互作用网络的构建及筛选核心靶点

通过STRING 11.0平台(https://string-db.org/)将获取的交集基因上传至“Multiple Proteins”项,在“Organism”项下筛选“Homo sapiens”,“minimum required interaction score”> 0.40的相关靶点,构建黄精与肺结核疾病共同靶点的蛋白质与蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。再将其tsv文件导入Cytoscape 3.7.2软件,创建可视化交互式网络,并利用“CytoNCA”插件精确计算网络拓扑参数,筛选出核心靶点。

1.7 基因本体论功能(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

首先针对黄精与肺结核疾病的共同靶点,利用R语言中data.table、tidyverse、org.Hs.eg.db程序包,将基因名称进行基因ID的转换,并利用R语言中clusterProfiler、enrichplot、ggplot2等程序包,对转换得到的基因ID进行基因本体论(gene ontology)功能富集分析,从细胞组分、分子功能、生物进程三个层面获取结果,同时进行京都基因和基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析,以便能更好地理解基因组学的基本原理。将P值设置为0.05,以获取准确的结果,并将其可视化呈现出来,以便更好地理解和数据分析。

1.8 药物成分-核心靶点分子对接验证结果

根据中药-活性成分-靶点-疾病网络,将重要的活性成分及其对应的关键靶点蛋白进行分子对接。从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取活性成分的二维结构,从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取靶点的蛋白结构。利用Discovery Studio 2019通过分子结构分析和分子对接技术,将对二者进行分子结构处理和分子对接,并以可视化形式呈现。

2 结 果

2.1 黄精的有效化合物

经过TCMSP筛选,本研究发现了12种黄精有效成分,它们的相关参数如表1所示。此外,本研究还绘制了它们的2D分子结构图,见图1,以便更好地了解其详细信息。

图1 黄精有效化合物的2D分子结构图

表1 黄精的有效化合物

2.2 黄精有效化合物的靶点

通过将黄精的活性成分输入Drugbank数据库系统,以提取到相应的靶基因,并将这些基因名称输入Uniprot数据库系统,以查询与之相关的靶点,经过整理,最终本研究获得了81个黄精治疗肺结核的靶点。

2.3 肺结核疾病相关靶点的预测结果

通过使用“Tuberculosis”或“TB”为关键词,分别在DrugBank、GeneCards、PharmGkb和OMIM数据库中进行预测,分别得到DrugBank(64个)、GeneCards(1718个)、PharmGkb(368个)和OMIM(89个)与肺结核疾病相关的靶点。本研究将所有收集到的靶点进行汇总,并删除文档中的重复值,最终得到2139个疾病相关靶点,见图2。

图2 肺结核靶点Venn图

2.4 黄精与肺结核疾病共同靶点的筛选及其PPI网络

利用R语言中的data.table、tidyverse、ggvenn程序包对81个黄精有效化合物靶点与2139个肺结核疾病靶点取交集,筛选得到41个共同靶点,即为黄精防治肺结核的重要靶点,见图3。利用STRING 11.0平台构建41个共同靶点的PPI网络图,得到40个节点(一个游离节点)和335条连线,如图4。利用Cytoscape 3.7.2软件绘制可视化PPI网络图,见图5;根据靶点度值(Degree)排序,排名前10的靶点包括AKT1(苏氨酸蛋白激酶,threonine protein kinase)、TP53(细胞肿瘤抗原p53,cellular tumor antigen p53)、PPARG(过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1,peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1)、JUN(转录因子JUN,transcription factor JUN)、HIF1-1α(低氧诱导因子1α,hypoxia-inducible factor 1α)、VEGFA(血管内皮生长因子A,vascular endothelial growth factor A)、CASP3(CASP3)、PTGS2(前列腺素G/H合成酶2,prostaglandin G/H synthase 2)、HSP90AA1(热休克蛋白hsp90)、FOS(蛋白质c-Fos)。靶点具体信息见表2。

图3 黄精-肺结核靶点Venn图

图5 共同靶点网络相互作用图

表2 核心靶点具体信息表

2.5 构建黄精-活性成分-靶点-肺结核网络图

按1.5的方法,将黄精活性成分、黄精与肺结核靶点汇总的数据导入 Cytoscape 3.7.2软件系统,建立起黄精-活性成分-交集靶点-肺结核网络图,该网络显示有52个节点、171条边(图6)。并采用软件中自带的Networkanalyze功能进行网络拓扑分析,将分析后的数据导出,并根据Degree值大小排序,筛选出3个关键活性成分,见表3。

图6 黄精-活性成分-交集靶点-肺结核网络图

表3 核心有效成分

2.6 筛选蛋白质相互作用网络的核心靶点

将2.4所得到的PPI网络.tsv文件导入Cytoscape 3.7.2软件构建相关Protein Interaction Network,并利用Cytoscape 3.7.2软件CytoNCA进行网络拓扑学分析和计算后,将所得数据分别对Bwteenness(BC)、Closeness(CC)、Degree(DC)、Eigenvector(EC),进行筛选,保留其大于中位值的数值,进行二次筛选,分别见图7、8,最终得到核心靶点JUN、HIF1-1α、VEGFA。

图7 第一次核心靶点筛选

2.7 交集靶点的GO功能注释和KEGG富集分析

通过对41个交集靶点的GO功能注释分析,最终获取了749个条目(P<0.05),其中Biological Processesing占了693个,Cell Components占了20个,Molecular Function占了36个。其中Biological Processesing与Cell Components分别为黄精通过相关靶点防治肺结核过程中所涉及的生物学过程以及相关的细胞成分,前者主要涉及对髓系细胞分化、对细胞外刺激的反应、对活性氧的反应、应对辐射、氧化应激反应、对脂多糖、细胞对化学应激的反应等;后者主要包含RNA聚合酶Ⅱ转录调控复合体、囊腔、胞质囊腔、分泌颗粒内腔、转录调节复合等;Molecular Function主要涉及其RNA聚合酶Ⅱ-特异性DNA结合、转录因子结合、一般的转录起始因子结合、DNA结合转录因子结合、泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合,GO功能注释柱状图如图9所示,KEGG富集分析主要集中脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波济肉瘤相关-疱疹病毒感染、神经退化-多种疾病的通路、人类巨细胞病毒感染、人体免疫缺陷病毒1感染、MAPK信号通路等,KEGG 信号通路气泡图如图10所示。结果提示,黄精是一种有效的抗炎药物,通过抗炎和改变相关转录、与结合因子结合,减少病毒感染和心血管并发症,这可能是黄精治疗肺结核的主要机制。

图9 GO富集分析图

2.8 药物成分-核心靶点分子对接验证结果

通过PubChem数据库下载得到的黄芩素(baicalein)、薯蓣皂苷元(diosgenin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)以及精确筛查出的JUN、HIF1-1α、VEGFA核心靶点通过分子对接的方式来实现两者之间的有效结合。当Libdockscore>95时,说明两者在微环境中可以有效且稳定的相结合。如表4所示,黄芩素、薯蓣皂苷元、β-谷甾醇与各靶点对接得到的Libdockscore均>97,表明黄芩素、薯蓣皂苷元、β-谷甾醇能够相对稳定的对接,其相关的PDB详细信息见表5。由图11可知,黄芩素、薯蓣皂苷元、β-谷甾醇主要是通过传统氢键、碳氢键、P-Pi共轭、碱基孤对电子与靶点结合。

表4 分子对接结果表

表5 基因PDB信息

3 讨 论

PTB是一种涉及复杂生理、生物机制的慢性肺部传染病[2],其中包括PI3K/AKT/mTOR信号通路、Wnt/β-catenin、JAK2/STAT3、IL-6/STAT3等通路,这些通路可与患者的治疗与预后有重要影响。对于使用的药物不同,其所含的活性成分也不同,相对应的靶点、机制都有所不同。

本研究通过相关数据库,分别筛选出了12个黄精有效成分以及81个作用靶点,以及2139个肺结核疾病靶点。利用R语言对靶点集合区交集,并获得了41个共同靶点。这些靶点即为黄精防治肺结核的潜在有效靶点,将所获得的共同靶点与所对应的中药活性化合物共同构建了黄精-活性成分-靶点-肺结核网络关系图,将其所包含的化合物按照度值(Degree)从大到小排序,3种主要成分为黄芩素-baicalein、薯蓣皂苷元-diosgenin、β-谷甾醇-beta-sitosterol,它们在度值排名中靠前。黄芩素是黄精所含的重要黄酮类化合物,具有抗菌作用,其可通过抑制CTX-M-1基因表达进而发挥抗肺炎克雷伯菌作用[7],同时具有抗金黄色葡萄球菌作用。此外,黄芩素还可通过抑制TLR4/NF-κB信号通路防止内皮细胞损伤,黄芩素还通过抑制肿瘤细胞和血管生长来抑制肿瘤进展[8]。同时黄芩素还可通过抑制AMPK/Mfn-2/MAPKs信号通路、抑制AP-1的转录活性发挥其抗炎作用[9]。黄芩素可降低ROS浓度的升高,抑制oxLDL降低的抗氧化酶表达,提高NO的生物利用度,稳定线粒体膜,激活分子促凋亡蛋白caspase 3,发挥抗动脉粥样硬化作用[10]。薯蓣皂苷元不仅能抗菌、抗病毒,还具有抗炎、抗氧化应激提高机体免疫力的作用[9],其可通过调控5-HT代谢,同时抑制小鼠和大鼠TLR2/MYD88/NF-κB信号通路,调节机体的炎症[11]。有研究证实,β-谷甾醇可促进肺炎球菌溶血素寡聚化,抵御肺炎链球菌的侵袭[12]。同时通过阻断IFN/STAT/RIG-I通路间的信号,缓解小鼠整体炎症及急性肺损伤。β-谷甾醇β-谷甾醇有着明显的抗癌活性,它能够阻滞非小细胞肺癌细胞的G0/G1细胞周期,有效抑制它们的生长进展,进而起到治疗效果[13]。

从所构建的PPI网络中通过对相关指标的中位值筛选得出其核心靶点分别为JUN、HIF1-1α、VEGFA。根据最新研究,JUN作为激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)家族的重要组成部分之一,在肺结核患者出现炎症反应过程中,JUN家族能够引发血管平滑肌细胞增殖、分化和迁移以及介导血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)进一步诱发炎症反应,同时核因子-κB(nuclearfactor-kappa B,NF-κB)也参与其中[14]。HIF1-1α存在于机体多种免疫细胞中,同时其可介导缺氧反应,通过促进胶原蛋白合成、纤维化和成纤维细胞增殖,增加炎症细胞浸润及纤维化,进一步促进炎症,同时诱导与气道重塑相关基因的活化[15]。VEGFA可促进体外血管内皮细胞的生长,诱导体内血管增生,增加血管的通透性,促进促炎因子的生成[16]。

GO功能富集分析结果显示,PPI所筛选的核心靶点涉及多个Cellular Components,Molecular Functions and Biological Processes。在黄精的有效成分作用于肺部细胞与微环境时,多是通过活性氧、细胞外刺激、miRNA转录正调控、对脂多糖、氧化应激反应等发挥相关作用,同时在作用过程中涉及到了转录调节复合物、RNA聚合酶Ⅱ转录调节复合物等肺部细胞及其微环境中的相关活性物质与蛋白,发挥转录辅助调控因子结合,DNA结合转录激活因子活性,RNA聚合酶-特异性DNA结合转录因子结合等分子作用。所涉及的相关活性物质与蛋白最终可通过IL-17信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等信号通路,发挥防治肺结核的宏观疗效。PTB涉及多种病理过程如纤维化、肺炎、肝脏疾病等[17-18]。

MAPK通路与细胞增殖、分化、癌变、凋亡、炎症及不同的生长刺激、应激刺激等生物学过程有关,同时交汇于多条信号转导通路,信号转导中枢的作用。在MAPK信号通路中,信号需要通过细胞表面接受并传导至细胞核内部,同时当细胞内物质如:细胞因子、神经递质等激活后[19],其功能发生变化:改变细胞对环境的应激适应性、影响细胞分化等。白介素17(interleukin-17,IL-17)是一种促炎性细胞因子(cytokine,CK),主要通过辅助性T细胞17(Th17)分泌,多种炎症因子通过其激活[20]。IL-17参与调控了中性粒细胞,使分化并转移,进一步推动了结核分枝杆菌(MTB)二次应答[21]调节局部炎症反应及宿主抵抗的级联反应[22]。在PI3K/Akt信号通路中通过IL-17A调控肺部细胞自噬,促进肺成纤维细胞增殖、产生细胞外基质,进而调节炎症和纤维化[23]。

黄精通过对多个靶点调控活性氧、细胞外刺激、miRNA转录正调控、对脂多糖、氧化应激反应等多个生物学过程,以及IL-17信号通路、MAPK、PI3K-Akt信号通路、癌症中蛋白聚糖、小细胞肺癌、细胞凋亡、肺结核等多个通路,从而发挥防治肺结核的药理作用。利用分子对接技术将黄芩素、薯蓣皂苷元、β-谷甾醇与JUN、HIF1-1α、VEGFA进行分子对接,对接结果显示各活性成分与核心蛋白之间均有较好的结合活性,表明黄精中的有效活性成分与相关基因之间能够稳定结合,发挥防治肺结核的作用。