柿叶总黄酮抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的作用研究*

王小平,周慧芬

(1.咸宁市中心医院/湖北科技学院附属第一医院血管外科,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院医学部基础医学院病理教研室)

动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是各种心血管疾病的基本病理学基础,其发病率呈上升趋势,严重威胁人类健康[1-2]。脂质代谢紊乱和炎症反应被认为是导致As的主要发病机制[3-4]。研究表明,血管内膜下荷脂的巨噬细胞大量蓄积导致泡沫细胞形成,是As发生发展的起始阶段[5]。因此,抑制巨噬细胞泡沫化对防治As源性心血管疾病具有重要意义。泡沫细胞的形成是脂质摄取增多或/和外排减少共同作用的结果[6]。抑制脂质摄取和/或增加脂质外排是抑制巨噬细胞泡沫化的重要策略。柿叶(Diospyros kaki)是我国传统的药用植物,用于治疗缺血性中风、心绞痛和高血压等疾病[7]。黄酮是柿叶的主要有效成分,具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗菌以及抗肿瘤等药理学作用[8-9]。新近研究表明[10],柿叶总黄酮(flavonoids from persimmon leaf,FPL)能减少apoE-/-小鼠As不稳定斑块。本研究主要探讨FPL对巨噬细胞脂质蓄积的影响,以期为As的防治提供新策略以及FPL作为药物开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

主要仪器:高速冷冻离心机(Eppendorf,德国),高效液相色谱(Perkin Elmer,美国),化学发光显影系统(天能,中国),显微成像系统(麦克奥迪,中国),T100 PCR反应仪(Bio-Rad,美国)。

主要试剂:THP-1人单核细胞系(ZQ0086,中桥新舟,中国上海),佛波酯(P1585,Sigma,美国),总RNA抽提试剂(R0016,碧云天,中国),cDNA合成试剂盒(D7178M,碧云天,中国),SYBR Green定量PCR预混液(D7262,碧云天,中国),细胞裂解液(P0013,碧云天,中国)ABCA1,SRA和GAPDH引物(上海生工,中国),鼠源性ABCA1单克隆抗体(AB18180,ABCAM,美国),兔源性SRA单克隆抗体(ab151707,ABCAM,美国),鼠源性β-actin单克隆抗体(66009-1-Ig,武汉三鹰,中国),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔/鼠二抗(A0208/A0216,碧云天,中国)。FPL为本实验自己提取,纯度>25%,其余试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 细胞培养与处理

体外采用含10%血清的RPMI 1640,5%CO2,37℃的恒温培养箱中静置培养THP-1细胞。使用160nmol/L的佛波酯处理THP-1细胞24h,诱导其分化为巨噬细胞,采用含50μg/mL氧化型低密度脂蛋白的无血清培养基孵育THP-1巨噬细胞48h,诱导其吞噬脂质变为泡沫细胞。采用不同浓度的FPL(0、0.5、1、2、4μg/mL)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24h,进行后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1 油红O染色

首先,按照之前描述的方法诱导巨噬细胞源性泡沫形成;然后,不同浓度的FPL与泡沫细胞共孵育处理24h后;接下来PBS洗涤,分别使用4%多聚甲醛固定细胞10min,80%异丙醇预染色5min,过滤后的油红O工作液(油红O母液∶蒸馏水=3∶2)染色30min,75%异丙醇脱色洗涤,苏木素复染细胞核5～10s以及0.3%盐酸酒精溶液脱色等过程后,甘油封片;最后,在400倍放大镜下观察并对细胞进行拍照。

1.3.2 泡沫细胞内胆固醇含量测定

收集处理后的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,经过PBS 3次清洗后,转移至0.9%NaCl溶液内制成细胞悬液,超声破碎细胞后离心保留上清液,待测;通过BCA试剂盒测定上清液蛋白质浓度作为内参标记;配置0～40g/L的标准胆固醇梯度溶液,与待测液分别通过高效液相色谱仪进行检测。检测条件:流动相为乙腈∶异丙醇∶正庚烷=53∶35∶12,流速为1mL/min,4℃柱温,检测波长是226nm,峰面积代表胆固醇含量。其中游离胆固醇(free cholesterol,FC)可直接检测,总胆固醇(total cholesterol,TC)在胆固醇酯酶处理后检测,胆固醇酯(cholesterol ester,CE)为总胆固醇与游离胆固醇的差值。胆固醇含量的单位用mg/g蛋白质表示。

1.3.3 荧光定量PCR

收集上述处理后的细胞,使用Trizol提取细胞内总RNA含量,并测定其浓度和纯度(A260/A280=1.9～2.0);取1000ng总RNA,按照cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录;每孔添加2μL逆转录的cDNA进行定量PCR检查。首先,95℃预变性10min,然后依次变性(95℃,15s)、退火/延伸(60℃,60s),循环40次。其中,ABCA1引物:上引物5’-ACCCACCCTATGAACAACATGA-3’,下引物5’-GAGTCGGGTAACGGAAACAGG-3’;SR-A引物:上引物5’-GCAGTGGGATCACTTTCACAA-3’,下引物5’-AGCTGTCATTGAGCGAGCATC-3’;GAPDH作为内参,其引物:上引物5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,下引物5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。

1.3.4 蛋白质免疫印迹(Western blot)

收集处理后的细胞于离心管中进行4℃、3000rpm离心10min,除去上清并用预冷的PBS进行清洗后,添加细胞裂解液进行冰上裂解15～20min,接着,12 000rpm离心10min,上清即蛋白溶液;收集蛋白溶液后,通过BCA检查蛋白含量;与上样缓冲液充分混匀后,水浴加热使蛋白变性,按照每孔30μg上样,进行聚丙烯凝胶电泳(80/120恒压,约90min);电泳结束后,通过湿转法进行转模(200mA恒流,2h);然后,分别孵育相应的一抗(4℃,过夜)、二抗(室温,2h);最后,进行化学显影。通过Gel-Pro软件对蛋白条带进行相对定量分析。小鼠单克隆抗体ABCA1(ABCAM,ab18180,1∶300),兔单克隆抗体SR-A(ABCAM,ab151707,1∶2000),小鼠单克隆抗体β-actin(武汉三鹰,66009-1-lg,1∶10 000)。

1.4 统计学方法

所有实验数据均采用均数±标准差表示,两组以上数据比较采用单因素方差分析与Dunnett多重比较检验。P<0.05认为存在统计学差异,实验数据均用GraphPad Prism 8.01软件进行作图和统计学分析。

2 结 果

2.1 FPL减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质蓄积

THP-1经过佛波酯诱导分化为巨噬细胞,与50μg/mL的ox-LDL共孵育形成泡沫细胞。不同浓度的FPL(0、0.5、1、2、4μg/mL)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞24h后,通过油红O对细胞进行染色,评估FPL对巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的作用。结果显示,FPL处理后,细胞内脂质含量随着处理浓度的增加逐渐减少(图1),提示FPL能够减少巨噬细胞源性泡沫细胞内脂质蓄积。

红染的为细胞内中性脂质,Scale Bar=300μm。

2.2 FPL减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量

细胞内脂质主要成分为游离的胆固醇、胆固醇酯等。我们通过高效液相色谱仪分析FPL对泡沫细胞内胆固醇含量的影响。如表1显示,当使用2μg/mL FPL处理泡沫细胞时,细胞内总胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)均显著降低。提示FPL能降低泡沫细胞内TC、FC和CE含量,抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积。

表1 不同浓度FPL对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量的影响

2.3 FPL减少THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞SR-A表达

减少细胞胆固醇摄取是抑制细胞内胆固醇蓄积的重要策略。SR-A是位于细胞膜表面主要的摄取胆固醇的蛋白质,我们检测FPL对泡沫细胞SR-A表达的影响。结果显示,2μg/mL FPL处理的THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞SR-A的mRNA和蛋白质水平显著降低(图2)。提示FPL能显著降低THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞SR-A表达,抑制胆固醇摄取,减少细胞内脂质蓄积。

A.qPCR检测FPL对泡沫细胞SR-A mRNA表达的影响;B.Western blot检测FPL对泡沫细胞SR-A蛋白表达的影响(与0μg/ml FPL相比较,*P<0.05,**P<0.01)。

2.4 FPL增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达

A.qPCR检测FPL对泡沫细胞ABCA1 mRNA表达的影响;B.Western blot检测FPL对泡沫细胞ABCA1蛋白表达的影响(与0μg/mL FPL相比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

三磷酸腺苷结合结转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)是位于细胞膜表面,介导细胞内胆固醇外排的关键蛋白。上调巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达能促进胆固醇流出,抑制泡沫细胞脂质蓄积。图3qPCR和Western blot结果显示,无论是mRNA还是蛋白质,随着FPL浓度增加,处理的细胞ABCA1表达水平显著增加,当超过2μg/mL FPL时,增加ABCA1表达水平有所下降;因此,我们认为2μg/mL FPL是ABCA1表达水平的最佳浓度效果。提示FPL可通过增加THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达,促进胆固醇流出,减少细胞内脂质蓄积。

3 讨 论

柿叶是一类中药,味苦、酸、涩,性凉,具有清肺、止咳、止血、活血化瘀和降血压等功效[11]。现代药理学研究证实[8],柿叶提取物具有扩张血管、降血脂抗氧化增强免疫等药理学作用。柿叶的主要有效成分是黄酮类化合物,主要包括黄芪甙、槲皮素等[8]。研究表明[10,12],FPL中具有抗As作用,但具体机制尚不明确。泡沫细胞是参与As进展的主要细胞之一,其主要来源于单核诱导分化的巨噬细胞和血管平滑肌细胞,其中巨噬细胞源性的泡沫细胞贯穿As发生发展的整个过程[6,13-14]。

胆固醇摄取是导致巨噬细胞脂质蓄积的重要原因[15-16]。相关研究表明[17],细胞摄取胆固醇的主要有受体依赖型和非受体依赖型两种方式。其中,受体依赖型是巨噬细胞主要的摄取方式,主要依靠SR-A等清道夫受体发挥作用[18]。SR-1位于细胞膜表面,具有识别并吞噬ox-LDL的功能[19]。Dai等研究表明[20],褪黑素通过抑制巨噬细胞SR-A表达减少巨噬细胞对ac-LDL的摄取,抑制泡沫细胞形成和As发生发展,提示下调SR-A是抑制巨噬细胞摄取脂质的重要策略。为进一步探究FPL对泡沫细胞脂质蓄积的影响,我们检测FPL对脂质摄取相关蛋白SR-A表达的影响,结果发现,FPL能减少巨噬细胞源性泡沫细胞SR-A表达,减少细胞内胆固醇含量,抑制脂质蓄积,进一步说明SR-A是抑制巨噬细胞脂质摄取的关键靶点。

增加胆固醇流出是抑制泡沫细胞脂质蓄积的重要方式。ABCA1是位于细胞膜表面的七次跨膜蛋白,具有介导细胞内胆固醇排出、抑制细胞脂质蓄积的作用[21-22]。上调ABCA1表达及其介导的胆固醇流出,能够减少巨噬细胞内脂质蓄积,抑制泡沫细胞形成,减缓As发生发展[23-24]。我们的结果显示,FPL处理的巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1表达明显增加,说明FPL可以上调ABCA1表达。

综上,本研究表明,FPL具有抑制巨噬细胞源性泡沫细胞脂质蓄积的作用,初步探索机制表明FPL不仅能够减少脂质摄取相关蛋白SR-A,而且上调胆固醇外排关键蛋白ABCA1,两方面共同发挥作用,减少细胞内脂质蓄积,抑制泡沫细胞形成。但FPL调控SR-A和ABCA1表达的具体机制尚未明确,这是后续我们需要探究的工作。

本研究从脂质代谢的角度证实了FPL的抗As作用,为进一步开发抗As药物提供了新的靶点和策略,对于As源性心血管病的防治具有重要理论意义。