子宫内膜癌患者NLRC5与自噬蛋白表达的相关性及其临床意义*

李燕，李从青，何闰华，卫兵

（安徽医科大学第二附属医院 妇产科，安徽 合肥 230601）

子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，也是女性生殖道常见的三大恶性肿瘤之一。根据流行病学统计，子宫内膜癌多发于围绝经期及绝经后女性，近年来发病率持续上升，且呈年轻化趋势[1-2]。目前，针对子宫内膜癌患者的治疗仍以手术为主，同时辅助放化疗，但对晚期患者的疗效仍然有限，且预后相对较差[3-4]。目前，临床认为影响子宫内膜癌患者预后的因素主要为病理类型、淋巴转移、肌层浸润深度等，而随着近年来进一步研究发现，NLR家族含CARD结构域5（NOD-like receptor family caspase activation and recruitment domain containing 5,NLRC5）在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色，且可能与疾病的预后密切相关[5]。NLRC5是近年来新发现的NLR样受体家族中的受体之一，通过干扰素（Interferon,IFN）和核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）分别与NLRC5的启动点相结合，可发挥NLRC5在细胞与细胞核之间穿梭的特性，增加了调控功能和范围[6]。自噬是人体自我保护机制，在内环境稳态及细胞器与蛋白质质量控制上具有一定意义，若缺乏或过度激活则可导致一系列病理系反应[7]。已有文献证实，自噬与子宫内膜癌的发病关系密切，但其与子宫内膜癌预后的相关性仍未完全明确[8]。基于此，本研究探讨子宫内膜癌患者NLRC5表达与子宫内膜癌患者自噬相关蛋白Beclin1、LC3表达的相关性，并探讨NLRC5、Beclin1、LC3与子宫内膜癌预后的相关性，旨在为子宫内膜癌预后制订相关防治方案提供参考意见。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月—2022年1月安徽医科大学第二附属医院90例子宫内膜癌患者的癌组织作为子宫内膜癌组，另取90例正常子宫内膜作为子宫内膜组。子宫内膜癌组平均（61.03±5.27）岁，平均体质量指数（22.98±1.03）kg/m2；正常子宫内膜组平均（60.74±5.15）岁，平均体质量指数（23.17±1.01）kg/m2。两组的年龄、体质量指数比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。纳入标准：①符合子宫内膜癌诊断标准[9]，且经组织病理学检查确诊；②FIGO分期为Ⅰ～Ⅲ期；③入组前均未接受过相关放化疗等治疗；④接受腹腔镜手术治疗；⑤患者及家属签署知情同意书。正常子宫内膜组均经宫腔镜取组织活检病理诊断为正常子宫内膜组织标本。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并凝血功能障碍；③合并多脏器功能不全；④有精神及认知功能障碍无法交流或配合。本研究已获医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应检测NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA表达

收集90例子宫内膜癌患者癌组织与正常子宫内膜标本组织。按照mRNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]说明书步骤提取组织总mRNA，使用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。以逆转录的cDNA为模板，采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA的表达。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火40 s，72℃延伸90 s，共循环45～50次；72 ℃延伸5 min。在扩增反应结束后，采用2-ΔΔCt法计算NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相对表达量。NLRC5正向引物：5'-CTATCAACTGC CCTTCCACAAT-3'，反向引物：5'-TCTCTATCTGCC CACAGCCTAC-3'，引物长度2 000 bp；Beclin1正向引物：5'-AGCACCATGCAGGTGAGCTT-3'，反向引物：5'-TGACACGGTCCAGGATCTTG-3'，引物长度929 bp；LC3正向引物：5'-AGCAGCATCCAACC AAATC-3'，反向引物：5'-CTGTGTCCGTTCACCAAC AG-3'，引物长度119 bp。以GAPDH为内参，正向引物：5'-GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC-3'，反向引物：5'-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3'，引物长度80～160 bp。

1.3 预后分组

术后对90例子宫内膜癌患者进行12个月的随访，按照实体瘤RECIST 1.0标准[10]：完全缓解为所有可测量病灶完全消失，且维持时间> 4周；部分缓解为各病灶最大径之和横径乘积减少≥50%，且维持时间> 4周；病情稳定为各病灶最大径乘积总和减少未超过50%或增大未超过25%，且维持时间>4周；病情进展各病灶最大径乘积总和增大超过25%，有新的病灶出现。完全缓解、部分缓解、病情稳定为预后良好，病情进展为预后不良。将子宫内膜癌患者根据预后情况分为预后不良组与预后良好组。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比或率（%）表示，比较用χ2检验。相关性分析采用Pearson法；影响因素的分析采用多因素一般Logistic回归模型；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC）曲线。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜癌与正常子宫内膜NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相对表达量比较

子宫内膜癌组与正常子宫内膜组的NLRC5、Beclin1和LC3 mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；子宫内膜癌组NLRC5 mRNA相对表达量较正常子宫内膜组低（P<0.05），Beclin1和LC3 mRNA相对表达量较正常子宫内膜组高（P<0.05）。见表1。

表1 子宫内膜癌组与正常子宫内膜组NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相对表达量比较 （n =90，±s）

表1 子宫内膜癌组与正常子宫内膜组NLRC5、Beclin1、LC3 mRNA相对表达量比较 （n =90，±s）

组别子宫内膜癌组正常子宫内膜组t 值P 值NLRC5 mRNA 0.49±0.10 1.00±0.12 30.974 0.000 Beclin1 mRNA 1.72±0.10 1.00±0.08 53.337 0.000 LC3 mRNA 1.58±0.08 1.00±0.15 32.367 0.000

2.2 NLRC5与Beclin1、LC3的相关性分析

NLRC5与Beclin1（r=-0.565，P=0.014）、LC3（r=-0.421，P=0.031）呈负相关；Beclin1与LC3呈正相关（r=0.462，P=0.025）。

2.3 预后良好组与预后不良组的临床资料比较

根据12个月的随访结果，预后良好的72例（80.00%）纳入预后良好组。预后良好组与预后不良组的年龄、体质量指数、脉管浸润、肿瘤直径比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。预后良好组和预后不良组的FIGO分期、宫体肌层深肌层占比、淋巴结转移、Beclin1、LC3、NLRC5 mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；预后不良组的FIGO分期、宫体肌层深肌层占比、淋巴结转移、Beclin1 mRNA、LC3 mRNA相对表达量高于预后良好组，NLRC5 mRNA相对表达量低于预后良好组。见表2。

表2 预后良好组与预后不良组的临床资料比较

2.4 子宫内膜癌预后影响因素的多因素一般Logistic回归模型分析

以预后为因变量，以FIGO分期、宫体肌层、淋巴结转移及NLRC5、Beclin1、LC3为自变量（赋值见表3），进行多因素一般Logistic回归分析（引入水准为0.05，排除水准为0.10），结果显示：FIGO分期Ⅱ、Ⅲ期[=3.760（95% CI：1.260，11.223）]、宫体肌层深肌层[=26.800（95% CI：7.043，101.984）]、有淋巴结转移[=11.324（95% CI：3.286，39.019）]及Beclin1 [=68.163（95% CI：2.537，643.326）]、LC3 [=26.468（95% CI：1.444，485.127）]均是子宫内膜癌预后的危险因素（P<0.05）；NLRC5 [=0.001（95% CI：0.000，0.079）]为保护因素（P<0.05）。见表4。

表3 赋值表

表4 子宫内膜癌预后影响因素的多因素一般Logistic回归分析参数

2.5 子宫内膜癌NLRC5、Beclin1、LC3表达对预后的预测价值

将NLRC5、Beclin1、LC3作为检验变量，将子宫内膜癌预后作为状态变量（0 =预后良好，1 =预后不良），绘制ROC曲线，结果显示，NLRC5的曲线下面积（area under the curve,AUC）为0.790（95% CI：0.652，0.929）、敏感性为82.8%（95% CI：0.784，0.923）、特异性为73.9%（95% CI：0.670，0.938）；Beclin1的AUC为0.742（95% CI：0.625，0.858）、敏感性为56.8%（95% CI：0.638，0.853）、特异性为77.8%（95% CI：0.644，0.877）；LC3的AUC为0.678（95% CI：0.546，0.810）、敏感性为57.3（95% CI：0.680，0.815）、特异性为72.2%（95% CI：0.693，0.824）；联合检测的AUC为0.887（95% CI：0.812，0.963）、敏感性为94.4%（95% CI：0.824，0.971）、特异性为62.5%（95% CI：0.593，0.778）。见表5和图1。

图1 NLRC5、Beclin1、LC3表达预测子宫内膜癌患者预后的ROC曲线

表5 子宫内膜癌NLRC5、Beclin1、LC3表达对预后的预测效能

3 讨论

我国流行病学统计，子宫内膜癌的发病率已成为仅次于宫颈癌的第二大常见妇科恶性肿瘤，约占全部妇科恶性肿瘤的20%～30%，严重威胁世界女性的健康[11]。近年来，随着治疗方案不断更新，子宫内膜癌的治疗效果明显改善，大部分早期患者手术治疗可有效得到根治，但晚期患者的生存率仍然较低。有研究表明，子宫内膜癌的治疗效果受到局部病灶未得到有效控制、远处转移、复发等诸多因素的影响，另外浸润深度、肿瘤体积、淋巴结转移等也是导致预后不良的因素[12-13]。但上述因素仍无法准确评估预后，对指导临床预后价值较低。因此，寻找影响子宫内膜癌的相关分子生物学特征，研究新型肿瘤分子标志物对判断患者预后、制订治疗方案等具有重要意义。

NLRC5又称MHCⅠ类反式激活因子（class I trans-activator,CⅠTA），是MHCⅠ类抗原提呈通路的主要转录激活因子，该基因定位于人类基因组的16q13，编码1 886个氨基酸，结构由3个区域组成，分别为C端亮氨酸重复（leucine-rich repeats,LRRs）区、NATCH区和N短的DD区。NLRC5基因功能缺失会影响MHCⅠ类基因的表达，导致CD8+T细胞无法有效活化，从而发生肿瘤细胞免疫逃逸。ZHAN等[14]相关研究发现，NLRC5与肿瘤抗原递呈密切相关，NLRC5表达缺失可导致子宫内膜癌患者NLRC5介导的自噬免疫逃避。SHUKLA等[15]研究亦发现，NLRC5是MHCⅠ类基因与APM基因的关键转录激活因子，NLRC5遗传损伤与表观遗传修饰是癌症中MHCⅠ缺陷的常见原因，均可说明NLRC5与癌症的发生、发展密切相关。本研究结果显示，子宫内膜癌组NLRC5表达较正常子宫内膜组低，且预后不良组的NLRC5表达低于预后良好组，NLRC5表达与Beclin1、LC3呈负相关，可见NLRC5低表达可能参与子宫内膜癌的发生与不良预后，且与自噬相关蛋白表达有关。分析原因可能是NLRC5受自噬调节，而自噬作为保守溶酶体降解途径，在该过程中细胞内物质可被降解与再循环。通过维持机体细胞代谢的平衡，可改善细胞的生存环境，阻断机体DNA突变，从而达到抑制癌细胞的作用。另外，自噬负责降解体内的毒性物质及相关分解产物，并再次利用，进而达到抑制癌细胞的效果。国外学者研究证实，自噬与炎症密切相关，在炎症相关的疾病中自噬发挥调控作用，在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌等癌症中可抑制肿瘤的发生[16]。

LC3主要负责形成自噬体的双膜延伸，在机体中以可溶性形式（LC3-Ⅰ）与膜结合形式（LC3-Ⅱ）存在，而其中LC3-Ⅱ是公认的最可靠自噬生物标志物[17]。Beclin1是自噬体形成过程中的重要分子之一，其可介导其他自噬蛋白定位于吞噬泡，对哺乳动物自噬体的形成与成熟起到关键的调控作用。Beclin1-P13KC3复合体利于吞噬泡聚集与组装，同时还可募集Atg16L等多聚体及LC3，利于促进吞噬泡的伸展扩展，使吞噬泡膜逐渐发展为环状结构。与传统抑癌基因相比，Beclin1基因仅在双等位染色体共同表达时才可发挥抑癌作用。LI等[18]研究发现，Beclin1可与E3泛素连接酶（Cullin 3,CUL3）相互作用，促进K48连接的泛素化与蛋白降解，另通过下调Beclin1蛋白表达可引起自噬活性下降。ZHU等[19]研究亦表明，Beclin1过表达说明自噬活性增强，而Atg5敲除后可增加Beclin1表达，从而对细胞增殖起到抑制作用，进一步诱导细胞的凋亡。本研究结果显示，子宫内膜癌组Beclin1、LC3表达较正常子宫内膜组高，且在预后不良组Beclin1、LC3也呈高表达，分析其原因可能如下：①自噬细胞通过对细胞异常增殖的抑制，可阻碍癌症的发生及进展。自噬可通过调节细胞周期的变化，改变细胞的增殖，使异常增殖的细胞停止细胞分裂。②自噬作为肿瘤的抑制与启动因子，其主要作用受到疾病类型、分期、肿瘤微环境等因素的影响。自噬水平的降低可促进肿瘤早期的癌细胞增殖，相反高表达可去除毒性成分，并提供循环生长因子，延长肿瘤微环境中癌细胞的生存时间[20]。

本研究多因素一般Logistic回归分析结果显示，FIGO分期Ⅱ、Ⅲ期，分化程度低中分化，宫体肌层深肌层，有淋巴结转移均为子宫内膜癌预后不良的危险因素，与周露秋[21]等研究结果相似。本研究中ROC曲线分析结果显示，子宫内膜癌NLRC5、Beclin1、LC3及3者联合预测子宫内膜癌预后不良的AUC为0.790（95% CI：0.652，0.929）、0.742（95% CI：0.625，0.858）、0.678（95% CI：0.546，0.810）、0.887（95% CI：0.812，0.963），提示临床可监测癌组织中NLRC5与自噬相关蛋白的表达，并采取针对性防治措施，以改善预后。

综上所述，子宫内膜癌患者NLRC5呈低表达，NLRC5与自噬相关蛋白Beclin1、LC3呈负相关，3者联合检测可提高子宫内膜癌患者的预后预测价值。