匹多莫德辅助化疗对肺结核大鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响及其机制探讨*

雷雪，张培源，王美玉，张红月，冯雪影

[大庆龙南医院（齐齐哈尔医学院第五附属医院） 临床药学科，黑龙江 大庆163453]

肺结核是由于机体免疫功能下降导致的一种肺部感染性疾病。我国肺结核疫情严重，且目前治疗方案疗效不佳，寻找治疗肺结核的新型有效药物至关重要[1-2]。肺结核化疗仅对结核杆菌具有一定的杀菌作用，在改善机体免疫上疗效不佳[3]。匹多莫德是一种二肽小分子，可有效改善固有免疫及获得性免疫，已有研究证实其对儿童哮喘、复发性生殖器疱疹T淋巴细胞亚群具有重要的调节作用[4-5]。但目前匹多莫德辅助化疗对肺结核的T淋巴细胞亚群影响较少，且作用机制尚不明确。本研究通过复制肺结核大鼠模型，探究匹多莫德辅助化疗对肺结核大鼠疗效及外周血T淋巴细胞亚群的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级、SD雄性大鼠65只，8周龄，体重185～235 g，平均（210±15）g，购自北京中国食品药品检定研究院，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0017，实验动物使用许可证号：SYXK（黑）2022-013。结核分歧杆菌标准菌株（H37Rv）购自北京结核病防治所。

1.2 主要试剂与仪器

异烟肼（国药准字H44020699，广东华南药业集团有限公司，规格：0.1 g），注射液用利福霉素钠（赛瑞辰）（国药准字H20050375，江西赣南海欣药业股份有限公司，规格：0.25 g），匹多莫德片（国药准字H20010091，唐山太阳石药业有限公司，规格：0.4 g），中性多聚甲醛上海（赫澎生物科技有限公司），大鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）酶联免疫试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），CD3、CD4、CD8 FITC单克隆抗体（湖北艾美捷科技有限公司），兔抗大鼠Toll样受体4（toll like receptor 4,TLR4）、核转因子κB（nuclear factor-κB,NF-κB）、髓样细胞分化因子88（myeloid differentiation factor 88,MyD88）单克隆抗体及山羊抗兔TLR4、MyD88、NF-κB二抗（湖北艾美捷科技有限公司）。

高速冷冻离心机（型号：Neofuge13，武汉益普生物科技有限公司），全光谱流式细胞仪（型号：Northern Lights，美国Cytek Biosciences公司），全自动生化分析仪（型号：PUZS-300，上海帝博思生物科技有限公司），石蜡切片机（型号：HS-3315，北京巴古顿生物科技有限公司），伯乐同用电泳仪（型号：XY-11014，上海信裕生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大鼠模型复制及分组 随机选取15只大鼠为对照组，其余大鼠复制肺结核模型。将H37Rv菌株培养20 d后，取部分菌落，加生理盐水（含5%吐温80）制成1×107cfu/mL菌悬液，取0.4 mL菌悬液，对大鼠进行尾静脉注射。约1个月后，大鼠出现皮毛颜色暗淡、稀疏凌乱，食欲不振，体重下降，活动明显减少，嗜睡，即大鼠肺结核模型复制成功[6]。其中5只大鼠模型复制过程中死亡，其余大鼠随机分为模型组、化疗组和联合治疗组，每组15只。

1.3.2 药物处理 模型复制成功后，根据人与大鼠的体重及给药剂量换算公式[7]，化疗组给予异烟肼50 mg/（kg·d），利福霉素钠50 mg/（kg·d），均腹腔注射。联合治疗组给予异烟肼50 mg/（kg·d），利福霉素SV钠50 mg/（kg·d），匹多莫德200 mg/（kg·d），均腹腔注射[8]。对照组与模型组给予等量的生理盐水。均连续治疗8周。

1.3.3 流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群 治疗8周后，采集大鼠眼眶静脉血2 mL，加入肝素抗凝剂及红细胞裂解液，混匀后加入1 mL缓冲液，2 000 r/min离心10 min，去除上清液再加入缓冲液0.1 mL，冲洗2次后分别加入CD3+、CD4+及CD8+T淋巴细胞单抗各1 μL，混匀后孵育30 min，采用流式细胞仪进行检测，记录细胞阳性染色百分比[9]。

1.3.4 大鼠胸腺指数和血清IgG水平 治疗8周后，采集大鼠眼眶静脉血2 mL，离心后取上清液，采用IgG酶联免疫试剂盒，按照说明书进行操作，梯度稀释标准品100 μL，加入50 μL上清液后混匀，依次加入酶标记物，显色剂A、B进行显色及终止液终止反应后，采用全自动生化分析仪检测血清IgG水平。采集血液后，对所有大鼠进行称重，并记录其体重。称重后所有大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉处理，每组取4只大鼠处死，取胸腺，采用滤纸擦干胸腺表面水分，采用电子天平进行称重，根据公式计算胸腺指数（胸腺指数=胸腺质量/体重）[10]。

1.3.5 大鼠肺组织病理学变化 取出4只大鼠胸腺后，立即取出其肺组织，清洗后置于4%中性多聚甲醛固定，使肺组织蛋白质凝固，采用酒精脱去肺组织中的水分，再溶于二甲苯中进行透明处理，将透明后的肺组织于溶化的石蜡中包埋，冷却后用石蜡切片机切成厚度为4 μm的切片，脱蜡后进行苏木精-伊红（hematoxylin eosin,HE）染色，于光镜下观察肺组织病理学变化[11]。

1.3.6 Western blotting检测脾脏TLR4、MyD88、NF-kB蛋白的表达 另取5只大鼠，处死后取出肺组织，液氮中冷冻。取100 mg冷冻肺组织，研磨成匀浆后加入细胞裂解液，对肺组织细胞进行裂解，测定肺组织蛋白浓度，在蛋白样品中加入上样缓冲液，进行电泳，分离TLR4、MyD88、NF-κB蛋白，转膜后洗去转膜液，室温封闭60 min，分别加入TLR4、MyD88、NF-κB及内参一抗、二抗，孵育后进行显影、定影，洗片后计算TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量。蛋白相对表达量=目的蛋白光密度值/β-Actin光密度值[12]。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群变化

对照组、模型组、化疗组、联合治疗组CD3+、CD4+、CD8+比较，经方差分析，差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，模型组、化疗组CD3+、CD4+降低，CD8+升高（P<0.05）；与模型组比较，化疗组及联合治疗组CD3+、CD4+升高，CD8+降低（P<0.05）；与化疗组比较，联合治疗组CD3+、CD4+升高，CD8+降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群变化 （n =15，%，±s）

表1 各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群变化 （n =15，%，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；②与模型组比较，P <0.05；③与化疗组比较，P <0.05。

CD8+11.64±0.69 16.10±0.61①14.20±0.79①②13.83±0.79②③95.738 0.000组别对照组模型组化疗组联合治疗组F 值P 值CD3+43.20±8.61 37.61±4.87①41.23±6.42①②45.98±8.89②③3.406 0.024 CD4+35.57±7.91 23.62±5.40①31.54±6.30①②34.69±7.40②③9.534 0.000

2.2 各组大鼠胸腺指数和血清IgG水平比较

对照组、模型组、化疗组、联合治疗组胸腺指数和IgG水平比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，模型组，化疗组胸腺指数和IgG水平均降低（P<0.05）；与模型组比较，化疗组及联合治疗组胸腺指数和IgG水平均升高（P<0.05）；与化疗组比较，联合治疗组胸腺指数和IgG水平升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠胸腺指数和血清IgG水平比较 （n =15，±s）

表2 各组大鼠胸腺指数和血清IgG水平比较 （n =15，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；②与模型组比较，P <0.05；③与化疗组比较，P <0.05。

IgG/（g/L）14.10±2.09 7.26±1.15①②10.23±2.01①②12.89±1.27②③48.847 0.000组别对照组模型组化疗组联合治疗组F 值P 值胸腺指数/（mg/g）0.37±0.05 0.22±0.05①0.27±0.04①②0.35±0.06②③28.775 0.000

2.3 各组大鼠肺组织的病理检测结果

对照组肺组织形态完整，肺泡清晰可见，无明显病理变化；模型组肺组织出现坏死、渗出，可见纤维组织增生及炎症细胞浸润；化疗组肺组织局部可见坏死、渗出，纤维组织增生及炎症细胞浸润减少；联合治疗组肺组织形态基本完整，仅少量纤维组织增生及炎症细胞浸润，肺组织坏死、渗出基本改善。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理切片 （HE染色×100）

2.4 各组大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量比较

对照组、模型组、化疗组、联合治疗组肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05）。与对照组比较，模型组、化疗组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量均升高（P<0.05）；与模型组比较，化疗组和联合治疗组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量均降低（P<0.05）；与化疗组比较，联合治疗组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量均降低（P<0.05）。见表3和图2。

图2 各组大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达

表3 各组大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量比较 （n =5，±s）

表3 各组大鼠肺组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量比较 （n =5，±s）

注：①与对照组比较，P <0.05；②与模型组比较，P <0.05；③与化疗组比较，P <0.05。

NF-κB 0.28±0.06 1.25±0.24①0.69±0.17①②0.35±0.08②③121.922 0.000组别对照组模型组化疗组联合治疗组F 值P 值MyD88 0.59±0.12 1.46±0.21①0.93±0.18①②0.53±0.09②③110.197 0.000 TLR4 0.32±0.10 1.72±0.35①0.84±0.16①②0.47±0.18②③124.060 0.000

3 讨论

肺结核一般发生于免疫力低下时，发病机制较复杂，涉及结核分枝杆菌的感染、复活和存活，免疫反应和炎症反应等多个环节[13]。临床上一般采用抗结核杆菌药物进行治疗，但疗效欠佳[14]。T淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，可通过分泌细胞因子和表达受体来调节免疫应答，在肺结核感染后，特别是在原发性感染时，T淋巴细胞参与对抗结核分枝杆菌的免疫应答的调节，激活巨噬细胞和其他免疫细胞，促进免疫反应形成[15-16]。因此，探究可有效改善T淋巴细胞亚群的方式对提高肺结核疗效具有重要意义。

胸腺是机体的免疫器官及T淋巴细胞分化成熟的部位，胸腺指数可直接反映机体的免疫能力[17]。本研究中肺结核大鼠外周血T细胞亚群及肺组织病理结果显示，模型组能够降低胸腺指数及CD3+、CD4+，提高CD8+，同时大鼠肺组织出现坏死、渗出、纤维组织增生及炎症细胞浸润等现象，表明机体免疫功能下降，肺组织损伤。经过化疗或匹多莫德辅助化疗后，胸腺指数及CD3+、CD4+升高，CD8+下降，免疫反应增强，肺组织病理明显改善。匹多莫德作为一种免疫调节剂，可调节Th1和Th2免疫应答平衡，促进细胞免疫应答（增加免疫调节细胞如调节性T细胞的数量和功能，有助于调节T淋巴细胞的活性；促进干扰素γ、白细胞介素-2生成，促进T细胞的活化和功能增强）。此外，匹多莫德还有抗氧化和抗炎作用，可减轻炎症反应并保护免疫细胞免受氧化应激损害，有助于维持T淋巴细胞的正常功能和活性[18-19]。张辉等[20]研究认为，匹多莫德可有效调节病毒感染相关性疾病CD4+、CD8+T淋巴细胞及两者比值，从而改善疗效。

本研究结果显示，治疗后模型组TLR4、MyD88、NF-κB蛋白相对表达量升高，而化疗组与联合治疗组降低，表明肺结核能够激活TLR/NF-κB通路，化疗及联合化疗均能抑制该通路。有研究发现，TLR/NF-κB信号通路在结核分歧杆菌感染中发挥重要作用[12]。结核分歧杆菌通过其表面的抗原与宿主TLR相互作用激活下游信号转导NF-κB信号通路。NF-κB是一种重要的转录因子，在调控多种炎症反应和免疫反应中发挥关键作用。在肺结核中，TLR激活可促使NFκB进入细胞核并结合到靶基因的启动子区域，从而引发炎症因子和免疫调节因子的启动。匹多莫德能够通过优化Th1/Th2免疫功能，抑制TLR/NF-κB通路，缓解炎症反应，部分炎症因子会引发机体固有免疫反应，促进细胞免疫应答，并将固有免疫逐步转化为获得性免疫反应，从而发挥更好的治疗效果。

综上所述，匹多莫德辅助化疗可改善肺结核大鼠外周血T淋巴细胞亚群，增强免疫功能，其作用机制可能与抑制TLR/NF-κB信号通路有关。本研究仍存在一定不足，如尽管人类与大鼠存在诸多相似之处，但仍面临着许多重要的生物学差异。通过动物实验获得的结果未必能直接适用于人类，可能会导致转化医学的困境，即难以将动物实验结果推广到人类疾病的治疗上。因此，今后研究中应鼓励和支持使用替代方法，如体外细胞模型、计算模拟和人体志愿者研究等，以提高研究结果的可靠性和可转化性。