血清外泌体中lncRNA SOX21-AS1的表达在宫颈癌诊断中的临床价值

周威英,陈 剑,吴伟平, 叶晓云,胡艳艳

(浙江金华广福肿瘤医院 1.检验科;2.妇瘤科,浙江 金华 321000;3.丽水市人民医院 检验科,浙江 丽水 323000;4.浙江金华广福肿瘤医院 消化内科,浙江 金华 321000)

宫颈癌(cervical cancer, CC)不仅是女性生殖器肿瘤最常见的肿瘤之一,也是女性恶性肿瘤最常见的肿瘤[1-2],中国宫颈癌占全球宫颈癌发生率的12%,占全球宫颈癌死亡率的11%[1]。高危型人类乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是宫颈癌发病的最主要原因之一,但从HPV感染发展到宫颈癌通常为5～10年,高危HPV感染致病宫颈癌的风险也不同[2]。宫颈癌早筛可以有效降低CC的发病率和致死率。

血清鳞状细胞癌抗原(SCC-Ag)是目前广泛使用的宫颈癌生物标志物,但其灵敏度不足,在早期肿瘤的检出率相对较低[3]。外泌体是一个纳米囊泡,由于携带蛋白质和核酸(mRNA, miRNA, lncRNA, DNA),作为生物标志物和治疗的潜在作用已引起了广泛关注[4]。长链非编码RNA(long noncoding RNAs, lncRNAs)参与人类多种肿瘤的发生及发展,其中lncRNA SOX21-AS1位于13q32.1染色体上,转录成2 986 nt的转录本,在人类肿瘤的多个枢纽中发挥癌症相关lncRNA的作用,如口腔癌、乳腺癌、宫颈癌、肾母细胞瘤[5-6]。本研究通过检测宫颈癌患者血清外泌体中SOX21-AS1 的表达水平,并与健康人员比较,分析其在宫颈癌中的诊断价值,以期为寻找早期诊断宫颈癌的生物标志物提供思路。

1 材料与方法

1.1 样本来源 收集浙江金华广福肿瘤医院2020年3月—2022年3月就诊的130例宫颈癌患者为观察组,收集50例同期健康体检的健康女性为对照组。观察组纳入标准:①年龄>18岁,无精神病病史;②病理学检查为宫颈癌;③就诊前1月无免疫、抗炎、抗感染、放化疗等治疗史;④知情同意。排除标准:①妊娠期、哺乳期女性,②有其他原发性恶性肿瘤,③有免疫、血液、神经等系统的严重性疾病,④有凝血功能障碍。观察组年龄30～65岁,平均(47.62±6.87)岁;宫颈鳞癌98例(高分化鳞癌30例、中分化鳞癌41例、低分化鳞癌27例),宫颈腺癌26例,腺鳞癌6例;初次确诊70例(鳞癌53例、腺癌16例、腺鳞癌1例),术后患者38例(鳞癌37例、腺癌1例),复发患者22例(鳞癌8例、腺癌9例、腺鳞癌5例)。对照组年龄28～65岁,平均(46.53±6.41)岁。所有的患者资料齐全,且手术之前没有接受过新辅助化疗或者相关放疗。本研究经过医院医学伦理委员会审批。

1.2 外泌体的分离及鉴定 采集宫颈癌患者和健康对照组的空腹外周血2 mL,不添加抗凝剂,自然条件下凝结1 h,取上清。经过低温(4 ℃)差速离心法提取外泌体,300 g离心10 min,取上清,低速离心除去细胞成分;2 000 g、3 000 r/min离心10 min,取上清,除去死细胞;10 000 g、5 000 r/min离心90 min,取上清,除去细胞碎片;100 000 g、5 000 r/min离心120 min,收集沉淀。外泌体重悬于PBS中,分装外泌体悬液,-80 ℃保存,使用时经4 ℃ 解冻,100 000 g、5 000 r/min离心70 min收集沉淀外泌体提取RNA或鉴定。透射电镜观察外泌体形态,纳米粒径仪测量纳米粒径。

1.3 RNA提取及分析 沉淀的外泌体经RNA快速提取试剂盒提取,血清中RNA提取经ZCIBIO试剂盒提取总RNA。经逆转录试剂盒合成cDNA,lncRNA SOX21-AS1使用SYBR Green Master(Rox)试剂盒扩增。所有样本都被重复分析3次,GAPDH作为内参,使用2- △△Ct对所有样本进行归一化处理分析。序列如下:

SOX21-AS1 forward:5’-CCTAACCCTTCACAACCAAAGA-3’

SOX21-AS1 reverse:5’-CTCAACCAGATTCAGGCAAGA-3’

GAPDH forward:5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’

GAPDH reverse:5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’

2 结果

2.1 外泌体鉴定 透射电镜下观察分离到的外泌体形态为一侧内凹的半球型双层囊膜结构,如封三图2A所示。纳米粒径仪测量可知,外泌体粒径为52～196 nm、平均(120.43±26.36)nm,见封三图2B。

2.2 血清外泌体lncRNA SOX21-AS1在宫颈癌患者中的表达水平 qRT-PCR检测显示,宫颈癌患者血清和血清外泌体中的SOX21-AS1水平高于健康对照组,见图1A、B。相对定量分析结果表示,宫颈癌患者血清中SOX21-AS1 的水平是健康对照组的3.16倍,外泌体中SOX21-AS1 的水平是健康对照组血清外泌体的3.83倍,见图1C、D、E。初诊、术后、复发患者与对照组的血清和血清总外泌体 SOX21-AS1水平,差异有统计学意义(P<0.05);但初诊、术后、复发患者间的血清和血清总外泌体 SOX21-AS1水平,差异无统计学意义(P>0.05),见图2。

图1 lncRNA SOX21-AS1在宫颈癌患者和健康人群中的表达水平

注:横坐标中A为初诊患者的血清RNA水平,B为初诊患者血清外泌体RNA水平,C为手术患者的血清RNA水平,D为手术患者血清外泌体RNA水平,E为复发患者的血清RNA水平,F为复发患者血清外泌体RNA水平,G和H分别为健康对照组的血清和血清外泌体RNA水平。

2.3 LncRNA SOX21-AS1作为宫颈癌生物标志物 在预测lncRNA SOX21-AS1对宫颈癌诊断的敏感性分析中发现,宫颈癌患者血清lncRNA SOX21-AS1 的AUC 为0.9267(95% CI 0.8886～0.9648,P<0.0001)、血清外泌体 lncRNA SOX21-AS1 的AUC 为0.9543(95% CI 0.9257～0.9829,P<0.0001),见图3。根据目前常用的CUT-OFF值确认的方法,以阴性对照组的2倍为阳性判断值,本次采用的CUT-OFF值为4.864,宫颈癌患者血清lncRNA SOX21-AS1的诊断敏感性为96.00%(95% CI: 86.54%～99.29%),特异性为80.77%(95% CI: 73.15%～86.62%);宫颈癌血清外泌体 lncRNA SOX21-AS1 的诊断敏感性为100%(95% CI: 92.87%～100%),特异性为73.08%(95% CI: 64.87%～79.96%)。宫颈癌患者血清外泌体中lncRNA SOX21-AS1的表达水平与宫颈癌的发病率具有更高的敏感性。

图3 血清(A)血清外泌体(B)中lncRNA SOX21-AS1的表达水平与宫颈癌发病的敏感性分析

3 讨论

宫颈癌筛查有助于早发现、早治疗,改善宫颈癌的预后,但目前对于宫颈癌的诊断、预后均缺乏高灵敏度和特异性的无创血清指标[7-8]。LncRNAs是一种分子量大于200 nt的非编码RNA,根据基因组中lncRNA的位点,可分为5种类型:正义型lncRNA,反义型lncRNA,双向型lncRNA,内含子lncRNA,基因间型lncRNA[9-10]。长链非编码RNAs参与人类多种肿瘤的发生及发展,其中lncRNA SOX21-AS1在许多类型的人类肿瘤中发生失调,可以通过调节血管生成、免疫和转移等方式参与肿瘤的发生发展[11-12]。如:LncRNA SOX21-AS1可海绵化MIR-7/VDAC1,促进宫颈癌的发展,提示可作为肿瘤诊断和预后的生物标志物[13];在阿尔茨海默病中,下调SOX21-AS1通过上调FZD3/5和激活Wnt信号通路来减轻神经元氧化应激,抑制神经元细胞凋亡[6]。

本研究结果显示,宫颈癌患者外周血中lncRNA SOX21-AS1的水平显著高于健康对照组,但是外周血中的RNA极易被降解,从而导致诊断的灵敏性下降。同时,宫颈癌患者血清外泌体中lncRNA SOX21-AS1的表达水平显著高于健康对照组血清外泌体,并在区分宫颈癌患者和健康对照时表现出更高的诊断AUC,而且在血清外泌体中lncRNA SOX21-AS1的敏感性为100%。分析原因可能是外泌体是直径范围为30～100 nm左右的球形囊泡载体,密度1.10～1.18 g/mL,是细胞与细胞之间交流的关键,在肿瘤中的研究具有多样性[14-15]。外泌体可以在体液循环中保护其内装载的蛋白质、RNA、DNA不被降解,可以稳定地高浓度存在于体液中,囊泡中携带的蛋白质、RNA、DNA为肿瘤的无创诊断提供了基础,从而保持较高的敏感度和特异性,可以显著降低临床诊断出现假阳性的可能[16-17]。同时,外泌体能够稳定存在于循环系统中,保护RNA和蛋白不被降解,因此更加大了其诊断价值。

LncRNA SOX21-AS1在不同的肿瘤类型中,分别表达为肿瘤抑制因子或启动因子[18]。有报道认为,SOX21-AS1 在肺癌中的表达与总生存率相关,SOX21-AS1的高表达是肺癌患者预后差的独立标志物[19]。本研究中,我们分析不同阶段的宫颈癌患者血清和血清外泌体中lncRNA SOX21-AS1的表达水平,评价了SOX21-AS1 水平在宫颈癌患者诊断中的临床价值,结果显示:外泌体SOX21-AS1水平具有更高的灵敏度和稳定性,血清外泌体SOX21-AS1在宫颈癌筛查与诊断中发挥至关重要的作用。今后,我们将进一步分析SOX21-AS1在治疗过程中的变化情况,分析是否可作为评价和监测宫颈癌患者疗效与复发的标志物。

综上所述, 血清外泌体中的SOX21-AS1 水平与宫颈癌的发生发展有关,可以作为宫颈癌临床诊断的生物标志物。