人核糖体蛋白S19在非小细胞肺癌中的表达及与顺铂耐药的关系

郑 艳,陆启光

(1.安吉县第三人民医院 呼吸科,浙江 安吉 313301;2.嘉兴市第二医院 呼吸内科,浙江 嘉兴 314000)

肺癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,发病率及死亡率较高,且每年发病率以26%左右的速度增长[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理类型之一,由于其癌细胞增殖缓慢,扩散及转移发生较晚,且侵袭力强,多数患者确诊时已属中晚期[2]。手术联合放化疗是治疗中晚期NSCLC患者的主要方法,铂类药物尤其是顺铂(cisplatin,DDP),是治疗NSCLC的一线药物,但长期使用铂类药物引起肺癌细胞产生的耐药性是导致癌症复发、治疗失败的主要原因[3]。肿瘤耐药成为了临床治疗癌症所面临的巨大挑战,探究肿瘤耐药靶点具有重要的临床意义。

核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)是一种广泛存在于生物体内的RNA结合蛋白,在细胞内蛋白合成中发挥重要作用,并调控基因的转录、翻译以及细胞的增殖、凋亡和分化[4]。RP在多种肿瘤细胞中异常表达,并与人肿瘤细胞耐药有关,但尚无RPS19参与调控NSCLC耐药性的相关报道[5-6]。本研究分析RPS19蛋白在NSCLC患者和细胞中的表达,并初步探讨RPS19与DDP耐药性之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料及样本收集 选取2019年6月—12月于安吉县第三人民医院东院呼吸科接受治疗的NSCLC患者50例。纳入标准:①国际肺癌TNM分期[7]为Ⅲ/Ⅳ期;②年龄18～80岁;③初次确诊且未接受过其他放化疗,择期行手术治疗;④卡氏(Karnofsky,KPS)评分>60分,预计生存期>3个月;⑤临床资料详实,患者及家属知情同意。排除标准:①小细胞肺癌患者;②合并心、脑功能不全或其他部位恶性肿瘤者;③近1个月有创伤手术史或大咯血史;④合并传染性疾病者;⑤肺功能先天性发育不全者。50例患者中,男32例、女18例,年龄39～78岁,平均(59.68±7.95)岁;肿瘤分期:Ⅲ期35例,Ⅳ期15例;病理类型:腺癌29例,鳞癌21例。术后收集50例患者的癌组织及癌旁组织样本。研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2 治疗方法 所有患者均接受局部切除手术治疗,及术后多西他赛联合顺铂常规化疗方案:第1天静脉滴注多西他赛75 mg/m2;第1～3天静脉滴注顺铂25 mg/m2;化疗期间每天静脉滴注5-羟色胺受体拮抗药物,预防消化道反应;化疗前1天至化疗后1天予以地塞米松口服,7.5 mg/次,2次/天。治疗周期为21天,共治疗2个周期。

1.3 样本检测 根据化疗的疗效将患者分为有效组与无效组,比较两组癌组织与癌旁组织中RPS19的mRNA及蛋白相对表达量。疗效判定标准[8]:化疗后功能状态(performance status,PS)评分≥3分为有效,PS评分<3分为无效。RPS19表达情况采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法和蛋白免疫印迹(WB)法检测。

1.4 体外实验

1.4.1 细胞 人非小细胞肺癌耐顺铂株A549/DDP购自上海博古生物技术有限公司, si-RPS19质粒、si-阴性对照(negative control,NC)序列购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.4.2 试剂与仪器 RPMI-1640培养基、胎牛血清、链青霉素、青霉素购自美国Gibco公司,LipofectamineTM2000转染试剂及试剂盒、二喹啉甲酸(quinaldic acid,BCA)蛋白定量分析试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)试剂盒购自美国Sigma公司,NIB900-FL型倒置荧光显微镜购自Leica公司,逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂盒购自日本Takara公司,ABI PRISM 7300型PCR仪购自Applied Biosystems公司,一抗、二抗购自Abcam公司,DDP,CCK-8试剂及试剂盒购自日本Dojind公司,Binding Buffer、Annexin V试剂及试剂盒、流式细胞仪购自美国BD公司。

1.4.3 细胞培养及转染 人非小细胞肺癌耐顺铂株A549/DDP接种于RPMI-1640培养基中,细胞融合度约80%时进行传代。取对数生长期细胞接种于6孔板,LipofectamineTM2000试剂盒转染293T细胞,更换完全培养基后继续孵育48 h,而后收集细胞上清,浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液。取100 μL慢病毒原液稀释至5倍,每孔加入上述1 mL稀释的慢病毒液,37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后加入浓度为5 μg/mL的聚凝胺,筛选稳转细胞株。将si-RPS19质粒、si-NC序列分别转染至A549/DDP细胞,分为si-RPS19组(敲低RPS19)、si-NC组(序列打乱的无意义对照)和空白对照组(未作任何处理的细胞株A549/DDP)。

1.4.4 RPS19 mRNA表达的测定 以TRIzol法提取临床样本和转染后A549/DDP细胞的总RNA,逆转录为cDNA。RPS19正向引物序列:GACAGGCACTCTGGAAATTG,反向引物序列:GCTCCTTCTTCTGCCTTGTTA;内参基因GAPDH正向引物序列:TAAGGTGGTACCGATTAAGC,反向引物序列:ACCCTAAGGATAACTCGTATT。使用ABI PRISM 7300型PCR仪进行实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR),反应条件:94 ℃ 10 min,1个循环;53 ℃ 30 s,74 ℃ 28 s,RPS19基因进行30个循环,GAPDH基因进行25个循环,最后72 ℃延伸2 min,RPS19 mRNA相对表达量以2-ΔΔCt表示。

1.4.5 RPS19蛋白表达的测定 RIPA裂解液提取临床样本和细胞的总蛋白,BCA法进行蛋白定量,总蛋白样品常规变性后依次电泳、转膜,5%奶粉封闭2 h,PBS洗膜3次,分别加入1∶1 000RPS19和GAPDH一抗4 ℃孵育过夜,PBS洗膜3次,再分别加入1∶5 000酶标二抗室温孵育1 h,洗膜后加入ECL显影剂,全自动电泳凝胶成像分析仪采集图像,Image软件分析灰度值。

1.4.6 各组细胞对不同浓度DDP的敏感性 取稳定转染的si-RPS19组、si-NC组和空白对照组细胞,经胰酶消化、重悬后,以5.0×103个/孔接种于96孔板,每组设置5个复孔,传代培养12 h。各组细胞依次加入不同浓度的DDP(0,100,100.5,101,101.5,102μg/mL)处理24 h,每孔加入CCK-8试剂10 μL,37 ℃含有5% CO2培养箱中孵育4 h后,于450 nm波长处用酶标仪测定光密度(OD)值,计算不同浓度DDP处理下各组细胞存活率,细胞存活率(%)=(D加药-D空白对照组)/(D0 μg/mL-D空白对照组)×100%。绘制细胞生长曲线,根据曲线计算DDP对细胞的半抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC50)。

1.4.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 将转染的各组细胞接种在6孔板上孵育过夜,依次加入不同浓度的DDP(0,100,100.5,101,101.5,102μg/mL)处理24 h,收集上清及细胞,4 000 r/min、4 ℃离心5 min。使用预冷的PBS洗涤细胞2次后,加入400 μL 1×Binding Buffer与细胞孵育,在细胞悬浮液中加入5 μL Annexin V,轻轻混匀后于4 ℃避光孵育15 min,再加入10 μL PI,于4 ℃避光孵育20 min,采用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

1.4.8 WB法检测凋亡相关蛋白的表达 RIPA裂解液提取si-RPS19组、si-NC组和空白对照组细胞总蛋白,经电泳、转膜后,5%奶粉封闭2 h,PBS洗膜三次,分别加入一抗、二抗孵育,取出条带漂洗,闭光显影,以GAPDH为内参,采用Image软件分析目的条带的灰度值,测定凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9的表达水平。

2 结果

2.1 临床样本RPS19 mRNA及蛋白表达情况 NSCLC患者癌组织中RPS19 mRNA及蛋白相对表达量均较癌旁组织升高;50例患者经DDP化疗后,36例有效,14例无效,无效组患者癌组织中的RPS19 mRNA及蛋白相对表达量均高于有效组;差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同临床样本RPS19 mRNA及蛋白表达情况比较

2.2 转染结果 人非小细胞肺癌耐顺铂株A549/DDP转染48 h后,于荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率约为85%,见封三图1。

图1 各组RPS19蛋白免疫印迹图

2.3 各组细胞RPS19 mRNA及蛋白表达情况 si-RPS19组RPS19 mRNA及蛋白相对表达量均较空白对照组、si-NC组降低(F=42.897、62.089),差异有统计学意义(P<0.001)。空白对照组与si-NC组的RPS19 mRNA及蛋白相对表达量,差异均无统计学意义(P>0.05)。见图1。

2.4 不同DDP浓度下各组A549/DDP细胞存活率及IC50值比较 如图2所示,各组A549/DDP细胞的存活率随DDP浓度的增加而下降。各个DDP浓度下,si-RPS19组A549/DDP细胞存活率均最低,差异有统计学意义(P<0.05);空白对照组与si-NC组间差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 不同DDP浓度下A549/DDP细胞存活率

2.5 不同DDP浓度下各组A549/DDP细胞凋亡情况比较 如表2所示,各组A549/DDP细胞凋亡率均随DDP浓度的增加而升高,且si-RPS19组的A549/DDP细胞凋亡率最高(P<0.05);空白对照组与si-NC组在各DDP浓度下的细胞凋亡率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。

表2 不同DDP浓度下A549/DDP细胞凋亡率比较

2.6 凋亡相关蛋白的表达情况比较 WB结果显示:与空白对照组、si-NC组比较,si-RPS19组的Bax、caspase-3及caspase-9蛋白相对表达量升高,Bcl-2蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);空白对照组与si-NC组的凋亡相关蛋白的相对表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3、图3。

图3 各组凋亡相关蛋白的蛋白免疫印迹图

表3 各组细胞Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9蛋白表达情况比较

3 讨论

NSCLC是在环境、烟酒、遗传等多种因素作用下发生于支气管黏膜上皮或肺泡上皮的恶性肿瘤,化疗是NSCLC晚期患者延长生存期、改善生命质量的首选治疗方式[9]。对于NSCLC患者的一线治疗通常采用铂类药物联合其他化疗药或抗血管生成药,其中顺铂已广泛应用于各类肿瘤的临床治疗,主要通过诱导快速无序增长的癌细胞内发生DNA-DNA或DNA-蛋白质交联,造成DNA结构和功能损伤,进而抑制癌细胞生长[10]。但治疗过程中癌细胞对顺铂产生的耐药性使整体治疗效果不尽人意,有研究[11]发现,肿瘤的死亡患者中约90%与抗癌药物的耐药性有关,且细胞耐药机制复杂,至今仍未清晰阐明,因此解决肿瘤耐药是目前临床肿瘤治疗中的首要任务。

真核生物的核糖体由4种rRNA和80多种RPs构成,是细胞内mRNA翻译成为蛋白的重要场所,任一组成部分的异常均能影响蛋白质的合成,进而导致机体细胞生长发育、增殖、分化的调控异常[12]。RP是核糖体的重要组成部分,具有参与调控基因的转录和翻译、调控细胞增殖和凋亡、分化等功能,并与前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种癌症疾病的发生发展密切相关,同时RP在肿瘤细胞的耐药性方面也发挥着重要作用[13-15]。Huang等[16]研究发现,维生素D可通过RPS3抑制脂质运载蛋白2调节的核因子κB通路激活,从而促进口腔鳞状细胞癌对顺铂的敏感性。RPS19是在先天性纯红细胞再生障碍性贫血研究中发现的一个RP,该类患者具有恶性肿瘤易感性,提示RPS19功能缺失可能与肿瘤发生有关,敲低RPS19能够抑制肿瘤细胞的生长并激活P53蛋白活性[17]。本研究发现,NSCLC患者癌组织中RPS19 mRNA及蛋白相对表达量均较癌旁组织升高,且无效组患者癌组织的RPS19 mRNA及蛋白相对表达量均高于有效组,由此可见RPS19可能参与肿瘤发生及顺铂耐药性。也有研究[18]发现,RPS19在乳腺癌和宫颈癌中显著高表达且在凋亡细胞中显著降低,并能与在肿瘤浸润性骨髓细胞上表达的补体C5a受体1相互作用,通过减少肿瘤细胞中的RPS19或阻断其与C5a受体1的相互作用,可抑制肿瘤的免疫应答。后续临床可进一步探索RPS19在肿瘤免疫应答中发挥的作用。

胡军等[19]研究发现,RPS19在NSCLC细胞中高表达,通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路下调RPS19的表达,可抑制肺癌细胞的侵袭、迁移及上皮间质转换。本研究结果显示:si-RPS19组RPS19 mRNA及蛋白相对表达量较空白对照组、si-NC组降低,且在同一DDP浓度下,si-RPS19组A549/DDP细胞存活率最低、凋亡率最高,si-RPS19组IC50值低于空白对照组、si-NC组,3组Bax、caspase-3及caspase-9蛋白相对表达量比较,si-RPS19组最高,Bcl-2蛋白相对表达量比较,si-RPS19组最低。可见,敲低RPS19表达能抑制A549/DDP细胞DDP的耐药性,同时能促进A549/DDP细胞凋亡,降低IC50值,其机制可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关,临床可深入探讨RPS19逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性的机制。

综上所述,RPS19在NSCLC中表达升高且与DDP的耐药性相关,调低RPS19的表达可抑制NSCLC细胞A549/DDP的增殖,并促进细胞凋亡,逆转A549/DDP细胞对DDP的耐药性。