高效液相色谱法测定腐乳中3种红曲色素

任意

上海市营养食品质量监督检验站/上海源本食品质量检验有限公司（上海 200090）

腐乳，又称豆腐乳，是豆腐经根霉或毛菌霉发酵，加盐腌制，根据需要放入酒及各种配料酿制而成的一种发酵豆制品，通常分为青方、红方和白方三大类。其中，红方是在后期发酵过程中，通过添加着色剂红曲，使腐乳表面呈现出一种红色。红曲色素，是一种我国传统的天然食用色素，其以大米、大豆为主要原料，通过红曲霉菌发酵提取而得到的一种混合物，包含3种色系，分别为红、黄、橙。混合物中大部分为醇溶性色素，少部分为水溶性色素。红曲色素的热稳定性和酸碱稳定性较好，光稳定性较差[1-2]。

由于不同生产工艺制成的红曲色素组成不同，这使得不同红腐乳所呈现的红色略有不同。我国关于红腐乳中红曲的研究多为菌种的研究，很少有关于其色素含量的研究。因此，结合GB 5009.150—2016《食品中红曲色素的测定》[3]，对红曲红胺、红曲素和红曲红素3种醇溶性色素进行含量的测定，同时优化检测条件，为研究红腐乳中3种色素含量提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20AT高效液相色谱仪（配SPD-M20A二级阵列管检测器，日本岛津公司）；Silversil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，北京迪马科技有限公司）；Master-D纯水机（上海和泰仪器有限公司）；BSA323S电子天平（精度0.001 g，德国赛多利斯集团）；XS105电子天平[精度0.000 1 g，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；GL20M医用离心机（江苏盐城市凯特实验仪器有限公司）；BE-2600多管涡旋混合仪（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；0.22 μm水相过滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司）；0.22 μm有机相针式滤器（尼龙，上海安谱实验科技股份有限公司）。

乙酸铵、乙酸、无水乙醇等（均为分析纯）；甲醇（色谱纯）；试验用水为18.2 MΩ·cm去离子水。

乙酸-乙酸铵溶液（pH 5.0）：称取0.77 g乙酸铵，加水溶解，用冰乙酸调整溶液pH至5.0，定容至1 L，混匀后经0.22 μm水相过滤膜抽滤后备用。

红曲红胺（N-Fmoc-8-Aminooctanoic Acid，CAS号126631-93-4，纯度99.14%，美国Panphy公司）；红曲素（Monascin，CAS号21516-68-7，纯度99.5%，美国Panphy公司）；红曲红素（Monascus Red，CAS号874807-57-5，纯度98%，美国Panphy公司）。

混合标准储备液：分别准确称取0.005 0 g红曲红胺、0.002 5 g红曲素和0.255 1 g红曲红素，用甲醇定容至50 mL，得到质量浓度分别为红曲红胺100 μg/mL、红曲素50 μg/mL和红曲红素5 000 μg/mL的标准储备液。

腐乳（市售）。

1.2 样品前处理

准确称取5 g（精确至0.001 g）搅拌均匀的腐乳样品于50 mL刻度离心管中，加入20 mL无水乙醇，涡旋振荡提取10 min，按5 000 r/min离心3 min，取上清液转移至另一50 mL刻度离心管中，向样品中再次加入20 mL无水乙醇，重复提取后离心，合并上清液，用无水乙醇定容至50 mL，混匀，取溶液过0.22 μm有机滤膜，上机待测（如提取液过于浑浊，可再次适当离心）。

1.3 色谱条件

Silversil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流动相A为甲醇，流动相B为乙酸-乙酸铵溶液（pH 5.0），梯度洗脱，洗脱程序见表1。流速1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样量20 μL；检测波长：红曲红胺264 nm，红曲素和红曲红素390 nm；运行时间40 min。标准色谱图见图1。

图1 红曲红胺、红曲素和红曲红素标准色谱图

表1 流动相梯度洗脱条件

1.4 标准曲线的绘制

准确吸取0，0.50，1.00，2.00，5.00和10.00 mL标准储备溶液（红曲红胺100 μg/mL、红曲素50 μg/mL、红曲红素5 000 μg/mL）于25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成质量浓度为红曲红胺0，2.00，4.00，8.00，20.00和40.00 μg/mL，红曲素0，1.00，2.00，4.00，10.00和20.00 μg/mL，红曲红素0，100，200，400，1 000和2 000 μg/mL的标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的选择

有关文献记载的关于食品中红曲色素的前处理条件有多种，如甲醇-乙酸乙酯提取结合凝胶渗透色谱（GPC）净化[4]、乙醇-水提取结合固相萃取柱（SPE）净化[3,5]、乙腈-水直接提取[6]等。红曲红胺、红曲素和红曲红素均为醇溶性色素，试验发现采用SPE小柱净化上柱时，如果待上柱液中有机溶剂比例较低，则红曲色素无法完全溶解，如果有机溶剂比例较高时，则不易被SPE小柱保留，同时腐乳中脂肪含量较少，蛋白质又难溶于乙醇，因此选择通过乙醇提取并离心的手段进行前处理。试验选取80%乙醇水溶液和无水乙醇对同一样品进行提取比较，结果发现采用无水乙醇进行提取含量更高。

2.2 线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

将红曲红胺、红曲素和红曲红素混合标准工作溶液依次进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归。称样量5 g，定容50 mL时，以3倍信噪比（rSN）计算3中红曲色素的检出限（SLOD），结果为0.031 2～28.8 mg/kg。以10倍信噪比（rSN）计算定量限（SLOQ），结果为0.104～96.0 mg/kg。其回归方程、相关系数R2、检出限和定量限见表2，标准曲线见图2～图4。

图2 红曲红胺标准曲线

图3 红曲素标准曲线

图4 红曲红素标准曲线

表2 3种红曲色素的线性范围、回归方程、相关系数R2、检出限和定量限

2.3 回收率和精密度试验

准确称取充分混匀的白腐乳，分别进行低、中、高3个加标水平的基质加标回收试验，每一水平分别进行6份平行试验，计算平均回收率和相对标准偏差，结果见表3，加标色谱图见图5。3种加标水平的基质加标回收率分别为91.5%～95.4%，95.6%～98.7%和98.8%～101.8%，相对标准偏差（SRSD，n=6）分别为1.02%～1.36%，0.76%～1.14%和0.36%～0.98%，方法具有良好的准确度和精密度。

表3 加标回收和精密度试验结果

2.4 样品含量测定

在试验条件下，分别对市场上6份不同红腐乳进行测定，结果见表4。

表4 6份红腐乳中红曲色素的含量测定结果单位：mg/kg

3 结论

试验采用无水乙醇直接提取，Silversil C18色谱柱进行分离，对腐乳中红曲红胺、红曲素和红曲红素的含量进行测定。相关系数R2为0.999 90～0.999 98，红曲红胺检出限为0.075 8 mg/kg，定量限为0.252 mg/kg；红曲素检出限为0.031 2 mg/kg，定量限为0.104 mg/kg；红曲红素检出限为28.8 mg/kg，定量限为96.0 mg/kg。回收率为91.5%～101.8%，相对标准偏差（n=6）为0.36%～1.36%。试验方法准确度高、精密度良好，可适用于腐乳中红曲红胺、红曲素和红曲红素含量的测定。