曲克芦丁对帕金森病大鼠多巴胺能神经元损伤及MAPK/NF-κB信号通路的影响

罗常月,屠淑敏,焦 鹏,申 霖,赵春艳,范层层

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是一种老年人常见的中枢神经系统退行性疾病,发病隐匿,病情呈进展性加重,主要病理表现为静息性颤抖、动作僵硬迟缓、行走入睡困难等,严重威胁人类健康[1]。PD发病机制复杂,有研究表明,神经损伤及脑黑质区多巴胺能神经元的病变坏死与凋亡是PD的主要病理表现[2]。氧化应激反应是导致多巴胺能神经元坏死的病理机制之一[3]。机体受损后体内氧自由基大量释放,引起超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)表达下调,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量上升,刺激细胞释放促炎因子,导致炎症反应发生,引起神经元凋亡[4-5]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路是机体重要的氧化应激与炎症反应调节通路[6]。有研究表明,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路参与调控细胞凋亡、纤维化反应[7]。目前临床治疗PD的药物如多巴丝肼片等左旋多巴制剂可一定程度控制症状,易造成肠胃不适及血压降低等不良反应[8]。曲克芦丁是一种半合成的黄酮类化合物,具有黄酮类化合物抗炎、抗氧化及抗凋亡的作用,由于具有抵抗血小板聚集的作用,临床上常用于心脑血管系统疾病的治疗[9-10]。本研究通过建立PD大鼠模型,探讨曲克芦丁对PD大鼠多巴胺能神经元损伤的保护作用及MAPK/NF-κB信号通路在此过程中的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60只无特定病原体(SPF)级雄性SD大鼠,6周龄,体质量200～220 g,购自杭州艾森医药研究有限公司,动物生产许可证号为SYXK(浙)2019-0019。饲养条件:温度22～25 ℃,湿度40%～45%,12 h昼夜交替,自由摄食饮水,适应性饲养1周后进行实验。

1.2 实验药物与试剂

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶盐酸盐(MPTP,YT1465)购自北京伊塔生物技术有限公司;多巴丝肼片(C14202006866)购自上海罗氏制药有限公司;曲克芦丁(SC11989)购自北京凯诗源生物科技有限公司;SOD(A001-3-2)、GSH-Px(A005-1-2)、MDA(A003-1-2)试剂盒及白细胞介素(IL)-6(H007-1-1)、IL-1β(H002)酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(G1120)、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)染色试剂盒(T2190)、RIPA高效蛋白裂解液(R0010)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(PC0020)、3,3′-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(DA1015)均购自北京索莱宝生物技术有限公司;细胞外信号调节激酶(ERK,9102S)、磷酸化-ERK(p-ERK,9101S)、JNK(9252S)、磷酸化-JNK(p-JNK,4668S)、p38MAPK(9212S)、磷酸化p38MAPK (p-p38MAPK,9215S)、磷酸化-NF-κB(p-NF-κB,3031S)、NF-κB(8242S)、β-actin(#4970)一抗、羊抗兔二抗(HRP,7074S)均购自美国CST公司。

1.3 实验仪器

Contour Elite三维光学显微镜购自美国布鲁克公司;TGel蓝光凝胶成像系统(OSE-470P)购自北京天根生化科技有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 模型建立与分组

将60只SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、曲克芦丁低剂量组、曲克芦丁中剂量组、曲克芦丁高剂量组,每组10只。除空白组外,其余5组参照文献[11]建立PD大鼠模型:大鼠每日称重1次,按照大鼠体质量于每日同时间腹腔注射MPTP溶液10 μL/g(35.1 mg MPTP溶于10 mL 0.9%氯化钠溶液中),空白组给予等体积0.9%氯化钠溶液,每日1次,连续注射5 d。建模成功后,阳性对照组给予多巴丝肼片250 mg/kg[12],曲克芦丁低剂量组、曲克芦丁中剂量组、曲克芦丁高剂量组分别给予曲克芦丁12.5、25.0、50.0 mg/kg[13],给药方式为灌胃给药,每日1次,连续灌胃14 d。

1.4.2 行为学测定

给药结束24 h后,对各组大鼠进行爬杆实验[14]测定行为学能力:设置一个直径约8 mm、高55 cm的直杆,将大鼠以头向上的形式置于直杆顶端,记录大鼠从头向上到完全转为头向下所需时间(即转头时间)及转头后爬下直杆所需时间(即爬下直杆时间),限时30 s,30 s内未爬下直杆记为30 s。

1.4.3 氧化应激指标与炎性因子检测

行为学测定结束后麻醉大鼠,眼静脉取血,以2 000 r/min离心15 min,分离血清,严格按照试剂盒说明书操作,检测大鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA、IL-6、IL-1β含量。

1.4.4 HE染色观察大鼠脑黑质多巴胺能神经元病理学损伤情况

取血后各组随机选择5只大鼠,处死后开颅取出完整脑组织,分离脑黑质并固定,常规乙醇脱水、石蜡包埋、切片,采用HE染色试剂盒进行染色,中性树胶封片,显微镜下观察大鼠脑黑质多巴胺能神经元损伤情况,并拍照记录。

1.4.5 TUNEL染色观察大鼠脑黑质多巴胺能神经元凋亡情况

取制备好的脑黑质切片,加入蛋白酶K工作液,37 ℃孵育1 h,再滴加2%山羊血清封闭30 min,加入TUNEL工作液,37 ℃孵育1 h,DAB染色,磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗3次,使用苏木精染核,封片后置于显微镜下观察并拍照记录。其中细胞核呈棕色为阳性细胞,计算神经元凋亡率,神经元凋亡率=视野内阳性细胞数/视野内细胞总数×100%。

1.4.6 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测大鼠脑黑质中NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白的表达

取各组剩余大鼠,处死后分离脑黑质,加入RIPA高效蛋白裂解液提取总蛋白,按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书严格操作,对各组总蛋白进行定量。各组取50 μg蛋白上样进行十二烷基酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、转膜,加入5%脱脂奶粉进行封闭,TBST洗膜后加入稀释的p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38MAPK、p38MAPK、p-NF-κB、NF-κB、β-actin(内参)一抗孵育液,4 ℃孵育过夜,再次使用TBST洗膜,加入HRP标记的羊抗兔二抗37 ℃孵育1 h,TBST清洗,采用电化学发光(ECL)液进行显色处理,凝胶成像系统扫描图像后分析蛋白条带灰度值,并进行相对定量分析。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学改变

与空白组比较,模型组大鼠转头时间及爬下直杆时间均延长(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组与曲克芦丁各剂量组大鼠转头时间与爬下直杆时间均缩短(P<0.05),且曲克芦丁各剂量组间具有剂量效应(P<0.05)。曲克芦丁高剂量组与阳性对照组转头时间及爬下直杆时间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠行为学改变(±s) 单位:s

2.2 各组大鼠血清氧化应激指标及炎性因子含量比较

与空白组比较,模型组大鼠血清SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05),MDA与IL-6、IL-1β含量升高(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组血清SOD、GSH-Px活性升高(P<0.05),MDA与IL-6、IL-1β含量降低(P<0.05),曲克芦丁各剂量组随着其剂量升高,血清SOD、GSH-Px活性逐渐升高(P<0.05),MDA与IL-6、IL-1β含量逐渐降低(P<0.05)。曲克芦丁高剂量组与阳性对照组血清氧化应激指标及炎性因子含量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血清氧化应激指标及炎性因子含量比较(±s)

2.3 各组大鼠脑黑质多巴胺能神经元病理学损伤改变

HE染色结果显示,空白组大鼠脑黑质组织结构清晰,神经元排列紧密整齐,细胞间质清晰,未见损伤;模型组大鼠脑黑质组织结构被破坏,神经元排列紊乱,间质水肿,出现空泡,视野中可见大量炎性细胞浸润。阳性对照组神经损伤较轻;曲克芦丁各剂量组随着剂量升高,神经元损伤逐渐减轻,细胞排列逐渐规律。详见图1。

图1 各组大鼠脑黑质多巴胺能神经元损伤情况(HE染色,×200)

2.4 各组大鼠脑黑质多巴胺能神经元凋亡情况

TUNEL染色结果显示,空白组神经元凋亡率为(10.05±1.61)%,与空白组比较,模型组大鼠神经元凋亡率[(65.19±5.87)%]升高(P<0.05);阳性对照组神经元凋亡率为(17.62±1.12)%,曲克芦丁低剂量组神经元凋亡率为(47.33±4.16)%、曲克芦丁中剂量组神经元凋亡率为(28.85±2.73)%、曲克芦丁高剂量组神经元凋亡率为(19.61±1.43)%。与模型组比较,阳性对照组与曲克芦丁各剂量组神经元凋亡率均降低(P<0.05),且曲克芦丁各剂量组具有剂量效应(P<0.05);曲克芦丁高剂量组与阳性对照组神经元凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。详见图2。

图2 各组大鼠神经元凋亡情况(TUNEL染色,×100)

2.5 各组大鼠脑黑质NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达比较

与空白组比较,模型组大鼠脑黑质组织p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均升高(P<0.05);与模型组比较,阳性对照组与曲克芦丁各剂量组大鼠脑黑质组织p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均降低(P<0.05),且曲克芦丁各剂量组具有剂量效应(P<0.05)。曲克芦丁高剂量组与阳性对照组脑黑质NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白表达比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。详见表3、图3。

图3 各组大鼠脑黑质中MAPK/NF-κB信号通路相关蛋白表达条带图(A为空白组;B为模型组;C为阳性对照组;D为曲克芦丁低剂量组;E为曲克芦丁中剂量组;F为曲克芦丁高剂量组)

表3 各组大鼠脑黑质中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值比较(±s)

3 讨 论

随着我国老龄化程度日益加剧,PD发病率逐年升高,给家庭和社会带来了沉重的负担。PD发病机制复杂,与环境、遗传及免疫应激等多种因素有关[15]。相关研究表明,多巴胺能神经元损伤是PD的主要原因[16]。多项研究显示,氧化应激、神经元凋亡及炎症反应均引起多巴胺能神经元损伤,进而影响神经功能[17-18]。本研究结果表明,PD模型建立后大鼠爬杆实验结果显示行为学功能受阻,且脑黑质多巴胺能神经元受损,凋亡率升高,血清SOD、GSH-Px活性降低,MDA与IL-6、IL-1β含量升高,提示PD大鼠模型建立成功,此时大鼠体内发生氧化应激与炎症反应,诱导神经元凋亡,损伤神经元,从而导致神经功能受损,大鼠行为学能力下降。

NF-κB是机体内重要的炎症转录因子,可调控免疫细胞的激活,炎性细胞的生成肿瘤细胞增殖分化,细胞凋亡等多种生理病理过程[19]。有研究表明,p-NF-κB激活炎性因子表达,产生大量促炎因子,反之,又诱导NF-κB信号通路激活,从而造成神经元凋亡增多,神经功能受阻[20]。抑制NF-κB信号通路相关蛋白的表达可减轻神经炎症反应,缓解PD大鼠行为学功能障碍[21]。多项研究显示,激活MAPK通路后,诱导p38MAPK与ERK磷酸化,介导炎性因子大量分泌,加剧炎症反应[22-23]。有研究表明,抑制MAPK/NF-κB通路的激活可减轻炎症反应,发挥神经保护作用[24]。本研究结果表明,PD大鼠脑黑质中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38MAPK/p38MAPK、p-NF-κB/NF-κB比值均升高,提示MAPK/NF-κB信号通路被激活,诱导炎性反应加剧,引起神经功能障碍。有研究显示,曲克芦丁可减轻氧化反应,清除氧自由基,保护神经细胞完整,从而发挥对脑缺血再灌注损伤模型大鼠脑损伤的保护作用[13]。本研究结果也显示,曲克芦丁干预后的PD大鼠血清SOD、GSH-Px活性升高,MDA与IL-6、IL-1β含量降低,脑黑质多巴胺能神经元损伤减轻,神经元凋亡率下降,大鼠行为学能力提高,提示曲克芦丁可减轻氧化应激、炎症反应及多巴胺能神经元损伤,从而保护PD大鼠神经功能。曲克芦丁对氧化应激与炎症反应等的作用具有剂量效应,其中曲克芦丁高剂量组与多巴丝肼片作用基本一致。本研究结果显示,曲克芦丁可下调ERK、JNK、p38MAPK、NF-κB磷酸化蛋白表达,提示曲克芦丁对PD大鼠脑黑质中MAPK/NF-κB信号通路的激活具有抑制作用。

综上所述,曲克芦丁可有效减轻PD大鼠氧化应激,抑制炎症反应,减轻多巴胺能神经元损伤,减少多巴胺能神经元凋亡,保护神经功能,可能与其抑制MAPK/NF-κB信号通路有关。但由于PD发生机制复杂,其具体机制仍需进一步研究。