三生调脂舒对糖尿病血糖波动大鼠Lp-PLA2活性表达的影响

丁 喆,李 军,朱 燕,王柔钧,季章龙,侯建婷,谢文皎

随着我国步入老龄化社会及人民生活饮食方式的变化,糖尿病发生率逐年升高[1]。流行病学调查显示,我国糖尿病病人已超过1亿例,成为威胁我国人民生活健康的重要疾病[2]。糖尿病的主要死因并非血糖升高,而是由血糖升高带来的一系列并发症,这些并发症需积极防治并抑制其进展,否则威胁病人生命[3]。相关研究显示,通过积极地降低血糖对部分病人仍不能有效抑制并发症进展,分析原因可能是由于血糖波动影响的[4]。糖尿病病人血糖波动幅度大,目前并无药物控制血糖波动,因此,如何有效调节血糖的波动是目前的研究热点。三生调脂舒是我院心血管内分泌科的多年经验用方,已在临床中得到较好应用,可治疗高脂血症、动脉硬化及糖尿病,特别是在调节血脂方面。前期实验显示,三生调脂舒具有多靶点调脂的功效[5]。三生调脂舒在糖尿病中的作用机制尚未明确。本研究构建了糖尿病血糖波动动物模型,以脂蛋白磷脂酶A2(lipoprotein phospholipase 2,Lp-PLA2)为核心指标观察三生调脂舒对其的作用,使本药用于糖尿病病人的治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验药物、动物与材料

1.1.1 实验药物

三生调脂舒购自我院药房[昆明市中医医院院内制剂,批号:滇药制字(Z)20082311A],主要由制何首乌、三七、薏苡仁、山楂等构成,使用时冲泡即可,每克药物相当于原生药1.7 g。

1.1.2 实验动物

雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠90只,体质量180～220 g,所有大鼠均购自昆明医科大学动物实验中心[动物合格证号:SCXK(滇)K2020-0004],饲养于云南中医药大学动物实验中心,由中央空调统一控制温度和湿度,室温20～26 ℃,湿度50%～60%,日常采用日光灯给予生活,12 h光暗循环。饲料和水均自由摄取。

1.1.3 实验试剂

链脲佐菌素(streptozocin,STZ)(美国Sigma公司,货号:V900890);胰岛素(来源于猪胰腺)(江苏万邦生化医药公司,货号:Y0001717);逸智型血糖仪和血糖试纸(德国罗氏公司);大鼠Lp-PLA2测定试剂盒(上海博湖生物科技有限公司,货号:BH-R101083);C肽测定试剂盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号分别为H391-1、A003-1-2和A001-3-2);白细胞介素-1α(interleukin-1α,IL-1α)测定试剂盒、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)测定试剂盒和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)测定试剂盒(上海酶联免疫生物科技公司,货号分别为ml028513、ml102828和ml002859);三酰甘油(triacylglycerol,TG)测定试剂盒、总胆固醇(total cholesterol,TC)测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)测定试剂盒和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所,货号分别为A110-1-1、A111-1-1、A112-1-1和A113-1-1)。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病动物模型的建立

90只大鼠适应性喂养2周,2周后随机选取10只作为正常组(Con组),其余80只参照文献[6]方法建立糖尿病大鼠动物模型,给予腹腔注射1%STZ的柠檬酸缓冲液建立糖尿病大鼠模型(剂量为60 mg/kg,为准确比较,Con组大鼠给予注射不含有STZ的柠檬酸缓冲液)。注射48 h后,每日09:00～10:00尾静脉采集大鼠血液监测血糖,当连续3 d血糖均≥16.7 mmol/L确认造模成功,对造模不成功的大鼠,于第4日注射STZ(30 mg/kg)再次造模,直到所有大鼠均造模成功为止。本研究共造模成功60只大鼠,造模过程中死亡20只。

1.2.2 血糖波动动物模型的建立

参照相关文献[7]报道,造模成功大鼠再次适应性喂养2周,选取10只作为持续糖尿病高血糖组,其余50只构建血糖波动模型。波动模型的建立方法:每日08:00～08:30、14:00～14:30注射0.38 g/kg 50%葡萄糖溶液,注射30 min后,注射1次胰岛素(根据血糖浓度调节胰岛素的注射量,统计单位注射量4～12 U),上述血糖波动模型连续给药6周(为保证结果具有可比性,持续高糖组及正常组腹腔注射等量生理盐水),在造模过程中,死亡8只大鼠,最后剩余42只大鼠成功构建血糖波动模型。血糖波动模型构建的标准为6周后,测量9个时间点(08:00、09:00、10:00、11:00、12:00、15:00、16:00、17:00、18:00)的血糖,并绘制血糖变化趋势曲线,从图中可见血糖波动组血糖变化较大,证明造模成功。详见图1。

图1 造模期不同时间血糖比较

1.2.3 动物分组

Con组10只,持续糖尿病高血糖组(Model-1组)10只,其余42只大鼠按照随机数字表法分为糖尿病血糖波动对照组(Model-2组,12只)、三生调脂舒低剂量组(SSTZS-L组,10只),三生调脂舒中剂量组(SSTZS-M组,10只)及三生调脂舒高剂量组(SSTZS-H组,10只)。

1.2.4 药物干预方法

干预时将三生调脂舒溶于蒸馏水,之后按照SSTZS-L组、SSTZS-M组和SSTZS-H组分别以0.5、1.0和2.0 g/(kg·d)三生调脂舒灌胃,Con组、Model-1组、Model-2组给予等体积的蒸馏水灌胃,干预时间为6周。6周的干预时间内,Model-1组死亡1只,Model-2组死亡4只,SSTZS-L组和SSTZS-H组各死亡1只,死亡原因均为糖尿病并发症。最终Con组10只,Model-1组9只,Model-2组8只,SSTZS-L组9只,SSTZS-M组10只,SSTZS-H组9只进行数据分析。

1.2.5 血液和组织收集方法

1)血清收集:末次给药结束后,分批将所有大鼠禁食12 h,于次日09:00腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液麻醉,麻醉后剖开腹腔,剪开胸隔膜,找到心尖处,收集大鼠血液,采用低温高速离心机,4 ℃条件下,以3 000 r/min离心10 min后,收集上清液,2～8 ℃保存,进行相关生化指标检测。2)腹主动脉收集:血液收集结束后,找出腹主动脉后取出,将其裁剪成2段,一段置于4%的多聚甲醛溶液中用于组织病理学,另一段置于超低温冰箱中用于蛋白表达检测。

1.3 观察指标

1.3.1 血糖检测方法

1)腹腔糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT):用药结束后按照美国糖尿病并发症动物模型协会制定的IPGTT操作[8]进行,实验前1 d严格禁食但不禁水12 h,于次日将每只大鼠进行称重,尾静脉取血后,采用血糖试纸快速测定空腹血糖;配制25%的葡萄糖生理盐水溶液,按照大鼠体重给予腹腔注射2.5 g/kg处理,注射后立即计时,分别于注射后0、30、60、120和180 min收集大鼠血液,采用血糖试纸对其进行血糖检测并绘图。2)血糖波动:平均血糖波动幅度(mean amplitude of glycemic excursions,MAGE)检测参照文献[9]报道方法:治疗结束后,测体质量及1 d内测定4次随机血糖。根据下列公式计算MAGE,MAGE=∑(λ/x),其中λ为每次血糖波动的最大值和最小值之差,x为有效波动的次数,ν为24 h平均血糖SD值。3)葡萄糖曲线下面积(area under curve of glucose,AUG):根据常规血糖检测的IPGTT结果绘制血糖曲线图,并计算AUG。AUG=(G0+G120)/2+G30+G60。

1.3.2 生化指标

Lp-PLA2、C肽、MDA、SOD、IL-1α、IL-6、TNF-α、TG、TC、HDL-C和LDL-C均根据试剂盒提供的说明书严格进行,结束后根据试剂盒提供的计算公式得到所测指标的数值。

1.3.3 组织病理学改变

采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察腹主动脉病理学改变,将腹主动脉从多聚甲醛溶液中取出,交由武汉塞维尔公司完成(按照常规方法,依次经脱水、切片及HE染色即可),返回切片后,采集图像,每张图片选取4个不同的视野。

1.3.4 相关蛋白表达

将腹主动脉从超低温冰箱取出,研磨后采用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白,之后采用二喹啉甲酸(BCA)法对其进行定量并调平,上述完成后每组各取20 μg蛋白溶液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电泳完成后裁剪目的蛋白的凝胶,采用半干转移法转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,之后采用5%的脱脂牛奶封闭2 h,洗涤3次。一抗封闭过夜,洗涤3次,二抗封闭30 min后,洗涤3次,完成后采用蛋白显影系统将其显影即完成。采用Image J计算各条带灰度值,进行比较分析。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 大鼠一般情况观察

所有大鼠适应性喂养期内均正常,饮食饮水良好,毛色光顺发白,反应灵敏。糖尿病模型造模成功后,Con组无显著变化,造模组大鼠表现为明显消瘦、精神不振,毛发枯燥发黄且不顺,反应迟钝及动作迟缓。血糖波动模型构建成功后,基本情况和糖尿病模型构建成功后无明显差异。给药后上述情况有一定的好转。

2.2 各组治疗后IPGTT各时间血糖比较

记录的5个时间点(0、30、60、120、180 min),与Con组比较,Model-1组、Model-2组及SSTZS各剂量组血糖均升高(P<0.05);SSTZS各剂量组低于Model-1组和Model-2组(P<0.05);30、60、120、180 min时,Model-2组血糖高于Model-1组(P<0.05)。详见表1。

表1 各组治疗后IPGTT各时间血糖比较(±s) 单位:mmol/L

2.3 各组大鼠血糖波动情况比较

与Con组比较,Model-1组、Model-2组及SSTZS各剂量组MAGE和AUG均升高(P<0.05);SSTZS各剂量组MAGE和AUG低于Model-1组和Model-2组(P<0.05);Model-2组MAGE和AUG高于Model-1组(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠血糖波动情况比较(±s)

2.4 各组大鼠血脂指标比较

与Con组相比,Model-1组、Model-2组及SSTZS各剂量组TC、TG和LDL-C均升高(P<0.05),HDL-C降低(P<0.05);SSTZS各剂量组TC、TG和LDL-C低于Model-1组和Model-2组(P<0.05),HDL-C高于Model-1组和Model-2组(P<0.05);Model-2组TC、TG和LDL-C高于Model-1组(P<0.05),HDL-C低于Model-1组(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血脂指标比较(±s) 单位:mmol/L

2.5 各组大鼠血清炎性因子含量比较

与Con组比较,Model-1组、Model-2组及SSTZS各剂量组炎性因子指标IL-1α、IL-6和TNF-α均升高(P<0.05);SSTZS各剂量组IL-1α、IL-6和TNF-α均低于Model-1组和Model-2组(P<0.05);Model-2组IL-1α、IL-6和TNF-α高于Model-1组(P<0.05)。详见表4。

表4 各组大鼠血清炎性因子比较(±s)

2.6 各组大鼠血清氧化和抗氧化应激指标比较

与Con组比较,Model-1组、Model-2组及SSTZS各剂量组MDA升高(P<0.05),SOD和C肽降低(P<0.05);SSTZS各剂量组MDA低于Model-1组和Model-2组(P<0.05),SOD和C肽高于Model-1组和Model-2组(P<0.05);Model-2组MDA高于Model-1组(P<0.05),SOD和C肽低于Model-1组(P<0.05)。详见表5。

表5 各组大鼠血清氧化和抗氧化因子比较(±s)

2.7 腹主动脉病理学改变

各组大鼠腹主动脉HE染色结果可见:Con组细胞排列整齐规则,血管壁纤维呈规则状;Model-1组细胞核排列明显紊乱,且血管内的纤维走向紊乱;Model-2组细胞核紊乱程度进一步加剧,同时纤维走向明显散乱;与Model-1组和Model-2组比较,SSTZS各剂量组明显好转。详见图2。

图2 各组大鼠腹主动脉血管改变(HE染色,×64)

2.8 各组大鼠血清、腹主动脉Lp-PLA2含量比较

与Con组比较,Model-1组、Model-2组及SSTZS各剂量组血清和腹主动脉Lp-PLA2表达升高(P<0.05);SSTZS各剂量组血清和腹主动脉Lp-PLA2表达低于Model-1组和Model-2组(P<0.05);Model-2组血清和腹主动脉Lp-PLA2表达高于Model-1组(P<0.05)。详见图3、表6。

表6 各组大鼠血清、腹主动脉Lp-PLA2含量比较(±s) 单位:μg/L

图3 各组大鼠腹主动脉Lp-PLA2蛋白表达条带图(A为Con组;B为Model-1组;C为Model-2组;D为SSTZS-L组;E为SSTZS-M组;F为SSTZS-H组)

3 讨 论

糖尿病归属于中医学“消渴”范畴[10]。关于此病的描述最早见于《素问·奇病论》[11],书中将糖尿病描述为“脾瘅”,核心为五气之溢,“五味入口,藏于胃,脾则行之精气,津液在脾中不能化则可至人口甘,此肥美所发地,此类人喜欢吃甜腻食品,长期以此则造成消渴”。三生调脂舒是我科研发的一种具有改善脂质代谢、抗氧化、抗炎症反应的中药制剂,已在临床中应用超过15年,立意点为“调养脾肾、活血化瘀、化痰泄浊”,由三七、山楂、制何首乌、薏苡仁等组成,其中制何首乌为君,补肾益肝、化浊降脂;薏苡仁为臣,健脾渗湿、补中益气;同时佐以生三七以实现行血活血、破瘀散结,佐以山楂以实现活血散瘀、化痰行气。四味中药共奏补肝益肾、活血化痰、疏肝健脾,标本兼顾、补脾益肾同时疏通气滞、血瘀、痰阻等标实[12-14]。多数糖尿病病人均表现为脾肾不足、血瘀痰阻,三生调脂舒的立意和糖尿病的发生机制具有明显的相关性。临床和动物实验研究表明,三生调脂舒对高脂血症具有明显的调节作用,可降低2型糖尿病病人超敏C-反应蛋白(hs-CRP)水平[15-16]。根据中医“异病同治”的理论,结合前期研究工作,推测三生调脂舒可能对糖尿病血糖波动具有一定的作用,其作用机制可能与调节血管特异性炎症标志物Lp-PLA2有关。

现代医学认为,糖尿病是以血浆或血清葡萄糖升高为主要特点的一类代谢性疾病,引起血糖升高的主要因素为胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用缺陷,降糖药物可降低血糖,但部分病人不能较好地控制相关并发症的进展[17-18]。血糖波动可能是造成糖尿病病人控制好血糖但并发症仍然进展的原因[19]。血糖波动是指病人血糖水平在每日高峰和低谷之间变化不稳定的一种状态,与胰岛素功能、饮食、药物及运动等密切相关,核心为胰岛素水平分泌不足或胰岛素效应不足造成的血糖波动有关[20]。为此,本研究构建了血糖波动动物模型,观察三生调脂舒对其的作用,结果显示,血糖波动的糖尿病大鼠模型相较于血糖稳定的大鼠模型具有高水平的血糖值和波动幅度,提示造模成功。另一方面间接说明血糖波动的糖尿病可能危害更大,采用三生调脂舒干预后,大鼠血糖和血糖波动指标MAGE和AUG均降低,表明三生调脂舒可改善糖尿病血糖波动大鼠血糖水平及血糖波动状态。

糖尿病血脂异常、炎症反应长期存在、抗氧化能力降低是造成糖尿病病人并发症的核心因素,特别是动脉粥样硬化和冠心病等[21]。本研究结果显示,与正常组比较,Model-1组和Model-2组血脂、炎性因子及抗氧化指标异常,表现为血脂TG、TC和LDL-C升高,HDL-C降低,炎性因子指标IL-1α、IL-6和TNF-α升高,抗氧化应激指标SOD和C肽降低,氧化应激指标MDA升高,Model-2组异常程度高于Model-1组。提示糖尿病血糖波动相较于普通糖尿病具有明显的血脂异常情况、炎症反应及抗氧化能力降低。与Model-2组相比,三生调脂舒干预后,上述指标均明显好转,提示三生调脂舒可改善血脂,降低炎症反应,调节氧化应激。同时本研究观察了糖尿病大鼠腹主动脉的变化:Con组细胞排列整齐有规则,血管壁纤维呈规则状;Model-1组和Model-2组细胞核紊乱程度进一步加剧,同时纤维走向明显散乱,血糖波动组严重,提示糖尿病血糖波动具有一定的动脉损伤,三生调脂舒治疗后明显好转。分析与Lp-PLA2相关,Lp-PLA2又称为血小板活化因子乙酞水解酶(PAF-AH),是一种炎性细胞(主要包括巨噬细胞、T细胞和肥大细胞),促使氧化磷脂水解的磷脂酶[22]。Lp-PLA2又反作用生成溶血卵磷脂和氧化游离脂肪酸等因子在内的多种脂类促炎性因子,造成IL-1α、IL-6和TNF-α等指标升高,最终导致动脉粥化硬化或冠心病的发生[23]。IL-1α、IL-6和TNF-α等炎性因子与抗氧化能力降低密切相关,可与SOD和C肽等协同作用造成机体抗氧化能力降低、动脉硬化及糖尿病等相关并发症发生[24-25]。本研究结果也显示,与Con组相比,Model-1组和Model-2组血清和腹主动脉组织Lp-PLA2升高,与文献报道[25]一致,这可能是糖尿病动脉粥样硬化发生的因素之一。采用三生调脂舒干预后,血清和腹主动脉组织Lp-PLA2含量均降低,提示三生调脂舒可能对糖尿病血糖波动大鼠血液和腹主动脉组织Lp-PLA2具有一定的抑制作用。

综上所述,三生调脂舒对糖尿病大鼠血糖波动具有明显的调节作用,其作用机制可能与调节Lp-PLA2表达,进而降低炎症反应、提高抗氧化能力水平有关。