基于Nox4/PKCα/Gal-3通路探讨柴胡皂苷D对心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响

李耀征,白保强,孙亚勤,王 贺

心肌梗死是一种死亡率较高的心血管疾病,多数病人因冠状动脉血栓、动脉粥样硬化引发,若不能及时治疗,导致心肌炎症损伤和纤维化,心功能障碍,最终造成心力衰竭,严重影响病人生命健康[1-3]。炎症反应在心肌梗死的病理生理过程中发挥着关键作用,抑制炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-1、IL-6等表达,下调致纤维化因子转化生长因子(TGF)-β1表达,减轻心肌炎症和纤维化,缓解心肌梗死引发的心脏重构过程[4-5]。NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,Nox4)和蛋白激酶Cα(protein kinase C-alpha,PKCα)是调控炎症及氧化应激的重要蛋白酶,激活两者活性,促使活性氧生成,并上调半乳糖凝集素3(galectin3,Gal-3)表达,引发组织细胞严重的炎症反应和过氧化损伤;下调Nox4,可抑制PKCα和Gal-3表达,减轻心肌炎症损伤,抑制心肌成纤维细胞激活,改善心肌梗死后的不良心脏重塑[6-7],由此可知,Nox4/PKCα/Gal-3通路是防治心肌梗死后心肌纤维化的靶点之一。柴胡皂苷D是常用中药柴胡中的主要活性成分,通过抑制核转录因子(NF)-κB信号转导发挥抗炎作用,维持阿尔茨海默病小鼠海马神经元正常形态,减少凋亡,减轻软骨组织炎症,抑制软骨细胞凋亡,改善骨关节炎症状[8-9]。张洁等[10]研究显示,柴胡皂苷D通过增加急性心肌梗死大鼠抗氧化能力,减轻心肌炎症损伤,保护心功能。本研究基于Nox4/PKCα/Gal-3通路探讨柴胡皂苷D对心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SD大鼠由南京青龙山实验动物中心提供,许可证号:SCXK(苏)-2018-0001,无特定病原体(SPF)级,雄性,体质量180～210 g,饲养在医院实验动物中心,严格按照《中华人民共和国实验动物管理条例》要求进行饲养,动物房温度23～25 ℃,湿度50%～55%,噪声≤50 dB。

1.1.2 实验试剂与仪器

柴胡皂苷D购自上海吉至生化科技有限公司(HPLC≥98%),货号S15760;Apocynin购自美国Selleck Chemicals公司,货号S2425;苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、Masson染色试剂盒、IL-6酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)试剂盒、RIPA裂解液购自南京建成生物工程研究所,货号分别为D006-1-1、D026-1-3、H007、A045-4-2、W062-1-1;IL-1β ELISA试剂盒、TGF-β1ELISA试剂盒、兔源β-actin一抗、兔源Nox4一抗、兔源PKCα一抗、兔源Gal-3一抗、羊抗兔二抗购自美国Abcam公司,货号分别为ab255730、ab119558、ab8227、ab133303、ab32376、ab76245、ab150077等。VisualSonics超高分辨率小动物超声成像系统购自百思德生物科技(北京)有限公司;HED-SY96S酶标仪购自山东霍尔德电子科技有限公司;CM1950冰冻切片机、Olympus CKX41光学显微镜购自德国徕卡公司;1659001蛋白电泳仪、Power-pac 3000转膜仪购自美国Bio-Rad公司;JS-1090P化学发光凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司等。

1.2 方法

1.2.1 心肌梗死模型大鼠制备及分组给药

参考文献[11]中方法制备心肌梗死模型大鼠:配制2.5%戊巴比妥钠溶液作为麻醉药,取SD大鼠52只,以30 mg/kg剂量腹腔注射,之后将大鼠仰卧固定在操作台,胸部备皮、消毒,切开胸骨左侧第4肋间、第5肋间,暴露心脏,小心分离冠状动脉左前降支结扎,至左心室颜色变白,还纳心脏,关闭胸腔,缝合伤口,即完成心肌梗死模型制备,大鼠死亡4只,成功造模48只。随机分为模型组、柴胡皂苷D(50 mg/kg)组、Apocynin(10 mg/kg)组、柴胡皂苷D+Apocynin组(柴胡皂苷D 50 mg/kg+Apocynin 10 mg/kg),每组12只。另选取12只SD大鼠只暴露心脏后分离冠状动脉左前降支,不结扎,设定为假手术组。

柴胡皂苷D及Apocynin溶于生理盐水,配制成5 mg/mL柴胡皂苷D药液[10]、1 mg/mL Apocynin药液[12]、5 mg/mL柴胡皂苷D和1 mg/mL Apocynin混合药液,各药物组大鼠均以10 mL/kg的剂量腹腔注射,假手术组、模型组给予等剂量生理盐水,每日给药1次,持续14 d。

1.2.2 超声检测大鼠心室功能

用药结束后24 h,将大鼠麻醉后仰卧固定,采用小动物超声多普勒血流仪检测各组大鼠左心室功能,通过超声心动图检查得到心室功能指标左室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、左室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

1.2.3 大鼠标本采集

超声检查结束后,使用注射器抽取4 mL颈动脉血,离心后,收集上清保存在-80 ℃冰箱中;之后处死大鼠,开胸分离心脏,剪取约0.5 g左心室心肌组织(于每只大鼠左心室相同位置采样)保存在液氮中,剩余组织浸入OCT包埋剂中,置于液氮中快速冰冻,采用冰冻切片机进行切片。

1.2.4 HE及Masson染色

将左心室心肌组织切片于冷丙酮中固定,经蒸馏水漂洗后,通过试剂盒进行HE及Masson染色,各染色5张,于显微镜下观察染色情况,每张切片选取5个视野拍照,以Image J软件分析心肌组织胶原容积积分(collagen volume fraction,CVF),CVF=(心肌胶原面积/所测视野面积)×100%。

1.2.5 血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平测定

将颈动脉血清提前解冻,采用ELISA法检测IL-1β、IL-6、TGF-β1水平,具体操作按照试剂盒说明指导进行。

1.2.6 心肌组织中Nox4/PKCα/Gal-3通路相关蛋白表达

取左心室心肌组织,加入1 mL RIPA裂解液,通过匀浆机制成匀浆液,4 ℃离心,取上清,以BCA法测定蛋白总浓度,配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶和浓缩胶,取含20 μg蛋白的各组样品液加入上样孔中,通过电泳仪进行电泳,之后湿转,将分离蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,使用5%的脱脂奶粉溶液封闭蛋白,分别加入兔源Nox4、PKCα、Gal-3、β-actin一抗,4 ℃孵育10 h,以TBST洗膜,加入羊抗兔二抗,室温孵育1.5 h,以TBST洗膜,使用凝胶成像系统拍照,通过Image-J软件分析蛋白条带灰度值,得到各蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织形态学改变

假手术组大鼠心肌组织形态正常,无病理损伤;模型组大鼠出现心肌细胞坏死、细胞间隙增大、心肌纤维断裂、组织肿胀等病理损伤;相较于模型组,各药物组大鼠心肌组织病理损伤减轻;相较于柴胡皂苷D组、Apocynin组,柴胡皂苷D+Apocynin组大鼠心肌组织病理损伤进一步减轻。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织形态学改变(HE染色,×200)

2.2 各组大鼠心肌组织纤维化变性

相较于假手术组,模型组大鼠心肌组织间隙有胶原增生,CVF升高(P<0.05);相较于模型组,各药物组大鼠心肌组织间隙胶原增生减少,CVF降低(P<0.05);相较于柴胡皂苷D组、Apocynin组,柴胡皂苷D+Apocynin组大鼠心肌组织间隙胶原增生进一步减少,CVF降低(P<0.05)。详见图2、表1。

表1 各组大鼠心肌组织CVF比较(±s) 单位:%

图2 各组大鼠心肌组织纤维化变性(Masson染色,×200)

2.3 各组大鼠心功能指标比较

相较于假手术组,模型组大鼠LVEDD及LVESD升高(P<0.05),LVEF及LVFS降低(P<0.05);相较于模型组,各药物组大鼠LVEDD及LVESD降低(P<0.05),LVEF及LVFS升高(P<0.05);相较于柴胡皂苷D组、Apocynin组,柴胡皂苷D+Apocynin组大鼠LVEDD及LVESD降低(P<0.05),LVEF及LVFS升高(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠心功能指标比较(±s)

2.4 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平比较

相较于假手术组,模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平升高(P<0.05);相较于模型组,各药物组大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平降低(P<0.05);相较于柴胡皂苷D组、Apocynin组,柴胡皂苷D+Apocynin组大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平比较(±s) 单位:pg/mL

2.5 各组大鼠心肌组织Nox4/PKCα/Gal-3通路相关蛋白表达

相较于假手术组,模型组大鼠心肌组织Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表达升高(P<0.05);相较于模型组,各药物组大鼠心肌组织Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表达降低(P<0.05);相较于柴胡皂苷D组、Apocynin组,柴胡皂苷D+Apocynin组大鼠心肌组织Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表达降低(P<0.05)。详见图3、表4。

表4 各组大鼠心肌组织Nox4/PKCα/Gal-3通路相关蛋白相对表达比较(±s)

图3 各组大鼠心肌组织Nox4/PKCα/Gal-3通路相关蛋白表达条带图(A为假手术组;B为模型组;C为柴胡皂苷D组;D为Apocynin组;E为柴胡皂苷D+Apocynin组)

3 讨 论

我国心肌梗死发病率逐年上升,且发病年龄日益年轻化,心肌梗死病人治疗窗口期短,易引发心肌肥厚、慢性心力衰竭等后遗症,是临床医学中亟须解决的难题[13-14]。心肌梗死发生后,心脏组织发生心脏重塑,心肌纤维化是其中关键部分,心肌梗死后心肌组织缺血缺氧,引发心肌炎症,进而诱导心肌成纤维细胞激活,造成心肌纤维化[15-16]。本研究通过结扎心脏冠状动脉左前降支构建心肌梗死模型,结果显示,造模大鼠心肌细胞坏死,细胞间隙增大,组织肿胀,心肌纤维断裂,且心肌间隙有明显的胶原增生,心肌CVF、LVEDD、LVESD及血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平升高,LVEF及LVFS降低,表明结扎心脏冠状动脉左前降支后,引发大鼠严重炎症反应,损伤心肌组织,诱导心肌纤维化,进而导致心室功能障碍,提示心肌梗死模型建立成功。

炎症在心肌梗死病理生理过程中发挥着重要的作用,可诱导心肌纤维化[4-5]。柴胡皂苷D是中草药柴胡中含有的一类皂苷衍生物,具有抗菌、抗炎、抗纤维化等多种药理活性,可减轻四氯化碳导致的大鼠肝组织炎症坏死和纤维化变性,并减轻过氧化氢(H2O2)和心肌梗死诱导的心肌细胞氧化应激反应,减少活性氧产生,保护心肌组织[10,17-18]。本研究以柴胡皂苷D处理心肌梗死大鼠,观察其对心肌梗死后心肌纤维化的影响,结果显示,心肌梗死大鼠经柴胡皂苷D处理后,大鼠心肌组织病理损伤减轻,心肌间隙胶原增生减少,心肌CVF、LVEDD、LVESD及血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平降低,LVEF及LVFS升高,表明柴胡皂苷D可下调炎性因子和致纤维化因子表达,抑制心肌梗死引发的心肌炎症,减轻心肌损伤及纤维化变性,改善心室功能。

Nox4/PKCα/Gal-3是调控炎症发生发展的重要信号通路,在高糖诱导的炎性损伤过程中Nox4、PKCα处于激活状态,下调两者表达,可减少活性氧生成,进而抑制炎症反应,减轻人视网膜内皮细胞向间充质转化,缓解糖尿病导致的组织器官纤维化;Gal-3是Nox4/PKCα的下游信号因子,下调其表达,改善皮肤炎症; Nox4/PKCα/Gal-3信号在心肌梗死后心肌纤维化过程中发挥着关键的调控作用,抑制其激活,可改善心肌梗死后的心肌纤维化导致的心脏重塑[7,19-20]。本研究中心肌梗死大鼠心肌组织Nox4、PKCα及Gal-3蛋白表达升高,以Nox4抑制剂Apocynin处理心肌梗死大鼠后,发现其可减轻大鼠心肌组织病理损伤及间隙胶原增生,并降低心肌CVF、LVEDD、LVESD及血清IL-1β、IL-6、TGF-β1水平,下调心肌组织Nox4、PKCα及Gal-3蛋白表达,升高LVEF及LVFS,与柴胡皂苷D对心肌梗死大鼠的作用相似,表明Nox4/PKCα/Gal-3通路参与心肌梗死大鼠的心肌纤维化过程,柴胡皂苷D可抑制其激活,减轻心肌纤维化;以柴胡皂苷D和Apocynin联合处理心肌梗死大鼠,较单独使用,可进一步增强柴胡皂苷D的作用,表明柴胡皂苷D和Apocynin可协同抑制心肌梗死引发的心肌炎症损伤和纤维化变性,进一步提示柴胡皂苷D可能通过抑制Nox4/PKCα/Gal-3通路激活,缓解心肌梗死后心肌纤维化。

综上所述,柴胡皂苷D可下调Nox4、PKCα、Gal-3蛋白表达,抑制炎症发生,减轻心肌损伤及纤维化变性,改善心室功能,抑制Nox4/PKCα/Gal-3通路激活可能是其药理机制之一。本研究仅进行了初步研究,证据稍显不足,今后应通过激活Nox4/PKCα/Gal-3通路进行对照验证。